1.本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物、核酸检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：2.犬片状边虫（anaplasma platys）是引起犬周期性血小板减少症的病原虫，主要是热带及温暖地区的犬易受影响，是一种广泛传播的疾病，革蜱属被认为属犬片状边虫的传播媒介。片状边虫感染的症状包括发烧、食欲减退，嗜睡，凝血异常及中度贫血等症状。目前用于片状边虫诊断的方法包括血液抹片，血清诊断及分子诊断。
3.犬巴贝斯虫病是由于巴贝斯虫（babesiagibsoni）寄生在宿主犬的红细胞中引起的一种严重的血液原虫疾病，能会造成的症状有发热、贫血、黄疽、脾肿大、血红蛋白尿、可视粘膜苍白等，重的可伴随急性肾衰、急性呼吸窘迫综合症，弥散性血管内凝血，肝病及神经综合症。巴贝斯虫属于梨形虫目（piroplasmida）巴贝斯科（babesiidae）巴贝斯属（babesia），是以蜱虫为中间宿主和传播媒介，在世界广泛流行。目前用于犬巴贝斯虫的诊断方法有临床诊断、血常规检查、尿液检查、血液涂片检查等。
4.目前诊断犬片状边虫与巴贝斯虫的最佳方式是分子诊断，尤其是利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）进行检测，这是一种更灵敏，且更具有专一性的技术。但目前的犬片状边虫与巴贝斯虫的pcr检测试剂盒存在以下技术缺陷：引物探针保守性较差，试剂盒检测的灵敏度较低；犬片状边虫与犬巴贝斯虫无法同时检测，费时费力。
技术实现要素：5.针对以上现有技术的缺陷，本发明提供用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物、核酸检测试剂盒及其制备方法，并达到以下发明目的：提高引物探针保守性、检测灵敏度，可同时检测犬片状边虫与犬巴贝斯虫，方便快捷。
6.为实现以上发明目的，本发明采用以下技术方案：分别设计犬片状边虫、巴贝斯虫与外参照的引物探针序列，共九条序列，如下所示：用于检测犬片状边虫的上游引物：5
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gcctaccaaggcagtgatctat-3’，序列记为seq id no: 1。
7.用于检测犬片状边虫的下游引物：5
’‑
cccattgtccaatattccccactg-3’，序列记为seq id no: 2。
8.用于检测犬片状边虫的荧光探针：5
’‑
cagccacactggaactgagatacggtc-3’，序列记为seq id no: 3，其中探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
9.用于检测犬巴贝斯虫的上游引物：5
’‑
ccgtgctaattgtagggctaatac-3’，序列记为seq id no: 4。
10.用于检测犬巴贝斯虫的下游引物：5
’‑
gctgccttccttagatgtggt-3’，序列记为seq id no: 5。
11.用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针：5
’‑
tttggcggcgtttattagttctaaacctccc-3’，序列记为seq id no: 6，其中探针5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团。
12.外参照的上游引物：5
’‑
cccatgtggatgcttcttatagtc-3’，序列记为seq id no: 7。
13.外参照的下游引物：5
’‑
ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3’，序列记为seq id no: 8。
14.外参照的荧光探针：5
’‑
ctgcactaaactggatcgcttggttcc-3’，序列记为seq id no: 9，其中探针5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
15.在扩增反应体系中，各成分终浓度分别为：pcr反应buffer在反应体系中的终浓度为1
×
；用于检测犬片状边虫的引物seq id no: 1和seq id no: 2在反应体系中的终浓度均为0.2μm；用于检测巴贝斯虫的引物seq id no: 4和seq id no:5在反应体系中的终浓度均为0.2μm；用于检测犬片状边虫的探针seq id no: 3、用于检测巴贝斯虫的探针seq id no: 6以及外参照的引物探针seq id no: 7-seq id no: 9在反应体系中的终浓度均为0.2 μm；酶混合液在反应体系中的终浓度为1
×
。
16.犬片状边虫与巴贝斯虫核酸联合检测的反应程序为：第一步：50℃ 2 min，第二步：94℃ 5 min，第三步：95℃ 15s，第四步：60℃ 30s，其中第三步与第四步循环40次，在第四步时采集荧光信号。
17.通过上述设计获得了一对犬片状边虫的特异性引物探针、一对犬巴贝斯虫的特异性引物探针，以及一对外参照的特异性引物探针。
18.同时，也可以根据实时荧光定量pcr的基本要求调整pcr反应体系与反应程序，也可以达到检测要求。
19.本发明设计的反应体系和反应程序，优化了反应体系和反应程序的扩增条件，实现了犬片状边虫与巴贝斯虫核酸联合检测试剂盒的以下有益效果：（1）本发明在犬片状边虫与巴贝斯虫的基因高度保守的区域设计引物探针，所设计的引物和探针具有较高的保守性，与其他病原体不存在交叉反应。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高的特点。
20.（2）试剂盒中的犬片状边虫、犬巴贝斯虫与外参照的基因序列特异、三种荧光探针分别使用三种不同的荧光基团标记，各自的荧光信号不会相互干扰，保证了检测的特异性。
21.（3）引入的外参照可以监控反应体系中是否存在反应抑制的现象，从而避免了因反应抑制引起的假阴性，因此，可以避免检测结果不准确造成的误诊，显著提高了检测的准确性。
22.（4）该方法操作简单，省时省力，试剂耗材成本较低，可直接对从疑似患病犬血液样本中提取的核酸进行检测，对检测平台和人工技术的要求较低，能够在常规检测中广泛推广。本发明可同时实现犬片状边虫和犬巴贝斯虫两种病原体的检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。pcr后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。
附图说明
23.附图1为采用本发明试剂盒对犬片状边虫检测的荧光定量标准曲线图；附图2为采用本发明试剂盒对犬巴贝斯虫检测的荧光定量标准曲线图；附图3为实施例3中本发明试剂盒检测1
×
10
3 copies/ml浓度的犬片状边虫人工合成质粒的扩增曲线图；附图4为实施例3中本发明试剂盒检测1
×
10
3 copies/ml浓度的犬巴贝斯虫人工合成质粒的扩增曲线图；附图5为实施例4中采用本发明试剂盒检测犬片状边虫的特异性实验结果图；附图6为实施例4中采用本发明试剂盒检测犬巴贝斯虫的特异性实验结果图。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明作具体介绍。应理解，这些实施方式仅用于对本发明的阐述，而不是限制本发明的范围。此外，需要说明的是，在阅读了本发明所阐述的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
25.实施例1、用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物的具体序列如表1所示：表1以上引物探针委托上海生工生物工程技术有限公司合成。
26.实施例2、用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒及其制备方法用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，包括1管pcr反应液、1管酶混合液、1管阴性对照品与1管阳性对照品。
27.所述pcr反应液包括pcr反应buffer、用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物；用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物的序列如表1所示。酶混合液：包括taq聚合酶与udgase；混合液和pcr反应buffer：购自菲鹏生物股份有限公司，货号md009h。
28.阴性对照品：te buffer。
29.阳性对照品：将犬片状边虫检测目标基因序列（seq id no: 10）、巴贝斯虫检测目标基因序列（seq id no: 11）和外参照检测目标基因序列（seq id no: 12）分别插入puc 57载体质粒，经由扩大培养、鉴定并质粒提取，分别得到犬片状边虫人工合成质粒、巴贝斯虫人工合成质粒和外参照人工合成质粒。将三种人工合成质粒混合，得到阳性对照品，其中，犬片状边虫人工合成质粒、巴贝斯虫人工合成质粒和外参照人工合成质粒浓度均为1
×
106拷贝/ml。
30.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法：步骤1、设计引物探针通过在genebank中对犬片状边虫与巴贝斯虫基因序列查询，选择犬片状边虫16s ribosomal rna gene基因的保守序列，记为seq id no: 10、巴贝斯虫small subunit ribosomal rna gene保守序列记为seq id no: 11，外参照的保守序列记为seq id no: 12。
31.seq id no: 10序列为：tacctagtagtatgggatagccactagaaatggtgggtaatactgtataatccctgcgggggaaagatttatcgctattagatgagcctatgttagattagctagttggtagggtaaaggcctaccaaggcagtgatctatagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagatacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagctatgccgcgtgagtgaggaa。
32.seq id no: 11序列为：ttggtattcgttttccatggataaccgtgctaattgtagggctaatacaagttcgaggcctttttggcggcgtttattagttctaaacctcccttggttttcggtgattcataataaactcgcgaatcgcttttagcgatggaccattcaagtttctgacccatcagcttgacggtagggtattggcctaccgaggcagcaacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatctaaggaaggcagcaggcgcgcaaactacccaatcctgacacagggaggtagtgacaagaaataacaatacagggcaattgtcttgtaattggaatgatggtgacgtaaaatctcaccagagtaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaacttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctgcgttgcccgactcggctacttgcctt。
33.seq id no: 12序列为：tcaaggaactaaaaagacccatgtggatgcttcttatagtcactgcactaaactggatcgcttggttccctttccttctcttcgacactgattggatgggccgtgaggtgtacggagtgg
accattcgacgaactattcggtggtggaaacattccagcatttgtgttaggagcgattgcggcagcggtaagtggtgtattggcgttgacggtgttgc。
34.针对片状边虫16s ribosomal rna gene序列中的一段保守序列seq id no: 10设计引物探针seq id no: 1
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seq id no: 3；针对犬巴贝斯虫small subunit ribosomal rna gene的一段保守序列seq id no: 11设计引物探针seq id no: 4
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seq id no: 6；犬片状边虫的探针使用的报告基团是fam荧光基团，犬巴贝斯虫的探针使用的报告基团是cy5荧光基团，同时，针对拟南芥suc2基因序列seq id no: 12设计外参照引物探针seq id no: 7
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seq id no: 9，外参照的探针使用的报告基团是vic荧光基团。
35.具体为：用于检测犬片状边虫的上游引物：5
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gcctaccaaggcagtgatctat-3’，序列如seq id no: 1所示。
36.用于检测犬片状边虫的下游引物：5
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cccattgtccaatattccccactg-3’，序列如seq id no: 2所示。
37.用于检测犬片状边虫的荧光探针：5
’‑
cagccacactggaactgagatacggtc-3’，序列如seq id no: 3所示，其中探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
38.用于检测巴贝斯虫的上游引物：5
’‑
ccgtgctaattgtagggctaatac-3’，序列如seq id no: 4所示。
39.用于检测巴贝斯虫的下游引物：5
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gctgccttccttagatgtggt-3’，序列如seq id no: 5所示。
40.用于检测巴贝斯虫的荧光探针：5
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tttggcggcgtttattagttctaaacctccc-3’，序列如seq id no: 6所示，其中探针5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团。
41.外参照的上游引物：5
’‑
cccatgtggatgcttcttatagtc-3’，序列如seq id no: 7所示。
42.外参照的下游引物：5
’‑
ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3’，序列如seq id no: 8所示。
43.外参照的荧光探针：5
’‑
ctgcactaaactggatcgcttggttcc-3’，序列如seq id no: 9所示，其中探针5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
44.以上引物探针委托上海生工生物工程技术有限公司合成。
45.步骤2、构建反应体系：pcr反应buffer在反应体系中的终浓度为1
×
；用于检测犬片状边虫的引物seq id no: 1和seq id no: 2在反应体系中的终浓度均为0.2μm；用于检测巴贝斯虫的引物seq id no: 4和seq id no:5在反应体系中的终浓度均为0.2μm；用于检测犬片状边虫的探针seq id no: 3、用于检测巴贝斯虫的探针seq id no: 6以及外参照的引物探针seq id no: 7-seq id no: 9在反应体系中的终浓度均为0.2 μm；酶混合液在反应体系中的终浓度为1
×
。
46.步骤3、建立反应程序犬片状边虫与巴贝斯虫核酸联合检测的反应程序为：第一步：50℃ 2 min，第二
步：94℃ 5 min，第三步：95℃ 15s，第四步：60℃ 30s，其中第三步与第四步循环40次，在第四步时采集荧光信号。
47.采用本发明试剂盒对犬片状边虫检测的荧光定量标准曲线如附图1所示；采用本发明试剂盒对犬巴贝斯虫检测的荧光定量标准曲线如附图2所示。
48.实施例3、用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的灵敏度验证实验将犬片状边虫检测目标基因序列、巴贝斯虫检测目标基因序列和外参照检测目标基因序列分别插入puc 57载体质粒，经由扩大培养、鉴定并质粒提取，分别得到犬片状边虫人工合成质粒、巴贝斯虫人工合成质粒和外参照人工合成质粒。
49.将犬片状边虫人工合成质粒配至浓度1
×
10
3 copies/ml，作为待检测目标a。
50.将巴贝斯虫人工合成质粒配至浓度1
×
10
3 copies/ml，作为待检测目标b。
51.采用实施例2的测试方法试剂盒及其使用方法，对1
×
10
3 copies/ml浓度的犬片状边虫人工合成质粒（待检测目标a）进行检测，设置7个重复，获得扩增曲线，扩增曲线图如附图3所示；通过附图3可以看出，设置的7个重复，7个扩增曲线全部起峰，说明采用本发明检测试剂盒检测1
×
103copies/ml的犬片状边虫，检出率为100％，即能全部检出，因此，采用本发明检测试剂盒检测犬片状边虫的最低检测限度可以达到1
×
103copies/ml，且检出准确，重复性好。
52.采用实施例2的检测试剂盒及其使用方法，对1
×
103copies/ml浓度的犬巴贝斯虫人工合成质粒进行检测（待检测目标b），设置7个重复，获得扩增曲线，扩增曲线图如附图4所示；通过附图4可以看出，设置的7个重复，7个扩增曲线全部起峰，说明采用本发明检测试剂盒检测1
×
103copies/ml的犬巴贝斯虫，检出率为100％，即能全部检出，因此，采用本发明检测试剂盒检测犬巴贝斯虫的最低检测限度可以达到1
×
103copies/ml，且检出准确，重复性好。
53.实施例4、用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的特异性验证实验试剂盒采用25 μl的反应体系，反应体系如表2：表2
设置检测犬片状边虫的特异性实验组，实验组设置8个pcr小管，均设置2个重复。分别向8个pcr小管中加入目标病原体犬片状边虫和其它干扰病原体（犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬支原体、犬钩端螺旋体、犬立克次氏体、犬埃立克体、犬瘟热病毒），所有病原体的浓度均为1
×
103copies/ml；进行荧光定量pcr，然后按照反应体系加入其他组分，进行扩增。上述检测犬片状边虫的特异性实验的检测结果图如附图5所示。
54.设置检测犬巴贝斯虫的特异性实验组，实验组设置8个pcr小管，均设置2个重复。分别向8个pcr小管中加入目标病原体犬巴贝斯虫和其它干扰病原体（犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬支原体、犬钩端螺旋体、犬立克次氏体、犬埃立克体、犬瘟热病毒），所有病原体的浓度均为1
×
103copies/ml；分别进行荧光定量pcr，然后按照反应体系加入其他组分，进行扩增。每个实验组设置8个pcr小管，设置2个重复。上述检测犬巴贝斯虫的特异性实验的检测结果图如附图6所示。
55.从附图5可见，采用目标病原体（犬片状边虫）与其他干扰病原体进行荧光定量pcr，除犬片状边虫扩增曲线起峰外，干扰病原体曲线并未起峰，说明该试剂盒检测犬片状边虫具有显著的特异性。
56.从附图6可见，采用目标病原体（犬巴贝斯虫）与其他干扰病原体进行荧光定量pcr，除犬巴贝斯虫扩增曲线起峰外，干扰病原体曲线并未起峰，说明该试剂盒检测犬巴贝斯虫具有显著的特异性。
57.需要说明的是，以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。凡采用同等替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均应包含在本发明的保护范围内。
技术特征：1.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物，其特征在于：包括用于检测犬片状边虫的上游引物、用于检测犬片状边虫的下游引物、用于检测犬片状边虫的荧光探针、用于检测犬巴贝斯虫的上游引物、用于检测犬巴贝斯虫的下游引物、用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针、外参照的上游引物、外参照的下游引物、外参照的荧光探针；所述用于检测犬片状边虫的上游引物：序列如seq id no: 1所示；所述用于检测犬片状边虫的下游引物：序列如seq id no: 2所示；所述用于检测犬片状边虫的荧光探针：序列如seq id no: 3所示，所述用于检测犬巴贝斯虫的上游引物：序列如seq id no: 4所示；所述用于检测犬巴贝斯虫的下游引物：序列如seq id no: 5所示；所述用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针：序列如seq id no: 6所示；所述外参照的上游引物：序列如seq id no: 7所示，所述外参照的下游引物：序列如seq id no: 8所示；所述外参照的荧光探针：序列如seq id no: 9所示。2.根据权利要求1所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物，其特征在于：所述用于检测犬片状边虫的荧光探针：5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；所述用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针： 5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团；所述外参照的荧光探针： 5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。3.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，其特征在于：包括pcr反应液、酶混合液、阴性对照品以及阳性对照品；所述pcr反应液包括pcr反应buffer、具有如seq id no: 1-seq id no: 9所示序列的引物和探针。4.根据权利要求3所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品：te buffer。5.根据权利要求3所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品：含犬片状边虫人工合成质粒、巴贝斯虫人工合成质粒和外参照人工合成质粒，浓度均为1
×
106拷贝/ml。6.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括设计引物探针、构建反应体系以及建立反应程序；所述设计引物探针：针对片状边虫16s ribosomal rna gene设计用于检测犬片状边虫的上下游引物和探针，序列如seq id no: 1-seq id no:3；针对巴贝斯虫small subunit ribosomal rna gene设计用于检测巴贝斯虫的上下游引物和探针，序列如seq id no: 4-seq id no:6；针对拟南芥suc2基因设计外参照的上下游引物和探针，序列如seq id no: 7-seq id no:9。7.根据权利要求6所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述构建反应体系：pcr反应buffer的终浓度为1
×
；用于检测犬片状边虫的引物seq id no: 1和seq id no: 2的终浓度均为0.2μm；用于检测巴贝斯虫的引物seq id no: 4和seq id no:5的终浓度均为0.2μm；用于检测犬片状边虫的探针seq id no: 3、用于检测巴贝斯虫的探针seq id no: 6以及外参照的引物探针seq id no: 7-seq id no: 9的终浓度均为0.2 μm；酶混合液在反应体系中的终浓度为1
×
。8.根据权利要求6所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述建立反应程序：第一步：温度50℃，时间2 min；第二步：温度95℃，时间10min；第三步：温度94℃，时间15s，第四步：温度60℃，时间40s，其中第三步与第四步循环40次，在第四步时采集荧光信号。
技术总结本发明提供用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物、核酸检测试剂盒及其制备方法，所述引物探针组合物包括用于检测犬片状边虫的上游引物、用于检测犬片状边虫的下游引物、用于检测犬片状边虫的荧光探针、用于检测犬巴贝斯虫的上游引物、用于检测犬巴贝斯虫的下游引物、用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针、外参照的上游引物、外参照的下游引物、外参照的荧光探针。本发明引物和探针具有较高的保守性，与其他病原体不存在交叉反应。本发明核酸检测试剂盒特异性强、灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。
技术研发人员：田永帅 杨帆 朱青 刘嘉男 刘万建 宋金铃 左雪梅
受保护的技术使用者：青岛汉唐生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
