1.本发明属于生物医药领域，涉及一种纳米治疗体系，特别是指一种刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系及其构建方法和应用。
背景技术：2.核酸适配体是指单链rna或从大量的寡核苷酸随机文库中筛选而来，具有高特异性、低免疫原性、易大规模合成dna分子，可通过折叠形成独特的二级或三级结构，并能够与靶分子特异性结合。dna适配体合成技术成熟且批次间差异小、物理稳定性好以及易于化学修饰等特点。
3.类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，ra）是一种常见的、以慢性滑膜炎症为特征的自身免疫性疾病，其病理特征表现为滑膜组织异常炎性增生、血管新生、血管翳形成、关节软骨和骨的不可逆性破坏，甚至引发畸形病变以及严重的并发症。ra患者关节滑膜微环境中常具有关节腔缺氧、炎性因子浸润、内皮细胞损伤和应激等特点，均可导致内皮细胞通透性改变，从而增加免疫细胞粘附，释放三磷酸腺苷（atp）。在生理条件下，细胞外atp浓度约为10 nm，由锚定在质膜中的外核苷酸酶调控。然而，在病理进程中，细胞外atp浓度可达到数百个微摩尔水平。因此atp适配体与智能响应纳米系统相结合时，它们可以在富含atp的环境中被atp特异性识别和激活。
4.肿瘤坏死因子（tnf-α）是一种重要的促炎因子，在各种慢性炎症尤其是ra的发病机制中起着至关重要的作用。tnf-α主要通过结合tnf受体1（tnfr1）和tnf受体2（tnfr2）来发挥作用。研究表明，tnfr1激活不仅可以引发促炎反应，而且也可诱导凋亡的相关信号通路。核酸适配体apt1-67可以特异性结合tnfr1，阻断下游相关信号通路，从而达到治疗类风湿性关节炎的效果。
5.dek是一种能够转移到细胞质，并进一步被分泌到细胞外的核蛋白，参与自身免疫反应。研究发现dek蛋白在中性粒细胞胞外网状陷阱（nets）的形成中发挥着至关重要的作用，核酸适配体dta（41 nt）可特异性结合dek蛋白，抑制nets形成，进而发挥抗炎作用。
6.分别针对靶向抑制tnfr和dek蛋白的研究均有，然而当前并没有能同时特异性靶向tnfr1和dek的体系，如何将不同靶向的适配体结合到一起，并且保证二者的活性，同时提高载药体系的稳定性，达到靶部位后响应atp后再释放dat和apt1-67，分别作用于不同靶点而发挥治疗ra作用是本发明要解决的技术问题。
技术实现要素：7.为解决上述技术问题，本发明提出一刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系及其构建方法和应用，克服了传统药物递送系统存在的技术问题。
8.本发明的技术方案是这样实现的：一种刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，步骤如下：
将三条ssdna（dta-s12、tr1s-9、apt
atp
）溶于缓冲盐溶液中，慢退火自组装形成atp响应型的双靶点核酸纳米结构溶液（dat）；优选的，上述步骤中三条单链直链dna的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3。
9.优选的，所述ssdna的物质的量浓度为2.5 μμ，三条链物质的量比为1:1:1。
10.优选的，上述步骤中缓冲盐溶液中含有终浓度为100 mm nacl、10 mm tris和0.1 mm edta溶液。
11.优选的，上述步骤中慢退火自组装的条件为95℃保持5 min、再由95℃慢退火至4℃。
12.优选的，需要使dat解链的atp溶液的浓度为2.5 mm，所述孵育的条件为37℃孵育0.5 h。
13.上述的方法得到的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系。
14.上述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系在制备靶向类风湿性关节炎药物中的应用。
15.本发明具有以下有益效果：1、本发明所构建的刺激-响应型核酸纳米治疗体系，将具有抗炎活性的核酸适配体dta和apt1-67组装成刺激-响应型核酸纳米结构，不仅可促进核酸适配体药物的递送，还可以提高二者的稳定性。atp刺激后，智能释放出dta和apt1-67，通过抑制nets的形成和调节nf-κb信号通路，发挥协同治疗作用。有利于核酸纳米药物dta和apt1-67在体内的精准递送，从而发挥较好的抗炎作用。
16.2、本发明所构建的刺激-响应型核酸纳米治疗体系，到达作用部位后，在局部高浓度atp的作用下，核酸纳米结构解链，释放出dta和apt1-67，分别与靶标蛋白结合，在空间位置上更好地保留适配体自身的活性位点，从而达到药物精准靶向、高效治疗的目的。
17.3、本发明所构建的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系可以同时作用于tnfr1和dek蛋白，不仅通过apt1-67与细胞表面的tnfr1作用调控下游细胞信号通路，还可以抑制dek蛋白阻止nets的形成从而发挥抗炎作用，是一种较好的多机制生物治疗手段，可避免传统化学治疗的毒副作用，有望成为一种新的治疗方法应用于类风湿性关节炎治疗。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为dat非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中从第1泳道到第6泳道依次为50bp dna marker, apt
atp
, tr1s-9, dtas-12, dat, dat+atp。
20.图2为dat与含10%胎牛血清的培养基孵育不同时间后的琼脂糖凝胶电泳图；从第1泳道到第9泳道依次为50bp dna marker, 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 h。
21.图3为atp响应型双靶点核酸纳米治疗体系对炎性l929细胞表达p-iκb的影响，其中a为western blot电泳图，b为灰度分析图。
22.图4为小鼠踝关节h&e染色病理切片图。
23.图5为小鼠足部micro-ct图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
25.本实施例一种刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的合成：将三条单链dna（dtas-12、tr1s-9、apt
atp
）等摩尔混合，并加入缓冲液（100 mm nacl、10 mm tris、0.1 mm edta溶液），使单链终浓度为2.5 μμ，低速涡旋使其混合均匀。将样品置于pcr仪中，先于95℃变性5 min，然后缓慢降温至4℃。刺激-响应型dat纳米结构合成，于4℃保存。
26.三条单链dna（dtas-12、tr1s-9、apt
atp
）的核苷酸序列如下表：向烧杯中依次加入h2o、30%丙烯酰胺、5
×
tae
·
mg搅拌混匀后，加入10%的过硫酸铵溶液与temed溶液，混合均匀后，立即胶注于玻璃板间，插入梳子，室温下聚合30 min。安装电泳装置，将1
×
tae
·
mg电泳液注入电泳槽中，拔出梳子，提前将电泳槽置于冰中降温，使电泳尽量在低温环境下运行。将6
×
dna上样缓冲液与样品以1:5的体积比混合，低速涡旋使其混合均匀后立即上样。在110 v条件下运行110 min，停止电泳。取出凝胶，将其置于eb（溴化乙锭）染色液中在室温下染色10 min，将凝胶放入超纯水中漂洗5 min后，用bio-rad凝胶成像仪对凝胶进行拍照处理。结果显示游离的apt
atp
迁移速率最快，随着碱基数目的增加，电泳条带迁移逐渐减慢，tr1s-9比dtas-12迁移慢，其中三条链组装后迁移速率最慢。各结构之间的迁移速率差别初步表明刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系构建成功。
27.向刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系溶液中加入atp，孵育后电泳。该结果显示，所制备的刺激-响应型核酸纳米治疗体系可在刺激物atp的作用下解链，解链后第六泳道条带推测为apt
atp
、tr1s-9、dtas-12，以及部分未完全与apt
atp
解链的dtas-12（图1）。
28.实施效果例1实施例1的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系体外稳定性研究称取1.00 g琼脂糖粉末于100 ml锥形瓶中，加入40 ml的1
×
tbe电泳液，用微波炉加热煮沸2 min使琼脂糖粉末完全溶解均匀，取出锥形瓶，待溶液冷却至80℃左右后加入1.6 μl的eb溶液，混匀后倒入模具中，插入梳子，室温冷却35 min，即得2.5%的琼脂糖凝胶。
67组相比关节腔较完整光滑，关节的炎症状态明显改善。结果表明，虽然dta、apt1-67和dat组对关节部位炎症的抑制效果不如阳性药依那西普，但相比对照组dta和apt1-67，经dat尾静脉给药治疗后具有更好的抗炎效果。
33.本实验采用micro-ct检测小鼠的骨骼侵蚀情况，结果见图5。扫描结果显示，生理盐水组骨骼关节面光滑平整，骨质正常，指节间的间隙适中，关节结构清晰；而模型组小鼠关节处的侵蚀现象较严重，骨骼破损严重。由于严重的骨侵袭作用，导致骨表面粗糙，骨质稀松，关节间的界限变模糊，骨侵蚀现象比较明显。各治疗组小鼠的关节骨质也均有不同程度损伤，en组踝关节破损较轻微；dta组的关节破损较严重；apt1-67组较dta组踝关节、骨质破损的病症有所缓解；dat与模型组相比，踝关节整体的骨侵蚀现象较轻微，指节连接处轮廓较清晰，骨表面较为正常，相对饱满光滑。说明对于关节炎诱发的骨损伤，经dat和apt1-67治疗后均能发挥一定的抗炎作用，并且dat核酸纳米药物展现出更好的抗炎效果。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，其特征在于，步骤如下：将三条ssdna溶于缓冲盐溶液中，慢退火自组装形成atp响应型的双靶点核酸纳米结构溶液。2.如权利要求1所述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中三条单链直链dna的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3。3.如权利要求2所述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述ssdna的物质的量浓度为2.5 μμ，三条链物质的量比为1:1:1。4.如权利要求3所述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中缓冲盐溶液中含有终浓度为100 mm nacl、10 mm tris和0.1 mm edta溶液。5.如权利要求4所述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中慢退火自组装的条件为95℃保持5 min、再由95℃慢退火至4℃。6.如权利要求5所述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述孵育的条件为37℃孵育0.5 h。7.权利要求1-6任一项所述的方法构建的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系。8.权利要求7所述的刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系在制备靶向类风湿性关节炎药物中的应用。
技术总结本发明属于生物医药领域，涉及一种纳米治疗体系，特别是指一种刺激-响应型双靶点核酸纳米治疗体系及其构建方法和应用。将三条单链直链DNA溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成具有三磷酸腺苷（ATP）响应的核酸纳米结构；95℃慢退火至4℃，完成双靶点核酸纳米治疗体系的构建。该核酸纳米治疗体系在生物体内ATP作用下解链后，分别作用不同的靶点，发挥治疗作用。本发明所构建的刺激-响应型双靶点核酸纳米结构，制备方法简单，不仅可提高单独适配体的稳定性，还可以增强双靶点核酸纳米治疗体系的靶向性，主要通过调控细胞信号通路发挥生物治疗作用。物治疗作用。物治疗作用。
技术研发人员：孙朋超 赵永星 张译 王肖楠
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
