1.本发明属于生物医药技术领域，涉及生物药物递送系统，特别是指一种双靶点复合核酸纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术：2.tnf-α与其受体tnfr1结合后引起的炎症信号通路在类风湿性关节炎的发生发展中起重要作用。生理条件下，tnfr1多数以单体形式存在，也可形成二聚体和三聚体。当tnf-α出现时，会招募tnfr1单体形成与之更易结合的二聚体和三聚体。tnf-α与tnfr1结合后，引起下游信号通路激活，促进大量炎症因子和促炎物质释放，造成关节软骨受损和骨组织破坏，引起慢性关节发炎、肿胀、疼痛、僵硬等症状。
3.tnfr1受体胞外区域包含四个富含半胱氨酸的结构域（crds），其中crd2和crd3区域是配体tnf-α与tnfr1受体结合的部位。crd1区域虽不与tnf-α直接结合，但对于tnf-α与tnfr1三聚化受体复合物的组装至关重要，且可在无配体的情况下促进tnfr1受体形成三聚体，因此这个结构域被称为前配体组装结构域（plad）。本课题组前期针对特异性结合tnfr1的核酸适配体进行筛选，筛选得到可精准、快速、牢固结合tnfr1的核酸适配体（专利 cn202010001295）。在前期研究的基础上，本课题组进行了深入的研究，探索如何制备能同时结合tnfr1不同区域，高效抑制tnfr1，解决tnfr1相关疾病治疗和生物药物递送存在的技术问题。
技术实现要素：4.为解决上述技术问题，本发明提出一种双靶点复合核酸纳米药物制备方法与应用，通过阻断tnfr1受体的聚合及tnf-α与tnfr1的结合双重作用，抑制tnfr1介导的炎症信号通路的激活，减少炎症因子的产生与释放，从而达到抗炎目的，用于类风湿性关节炎的治疗。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种核酸适配体和多肽交联的双靶点复合核酸纳米药物，所述双靶点复合核酸纳米药物是将核酸适配体a和多肽p以不同的方式修饰到td上得到的。
6.进一步，所述a为特异性结合tnfr1中plad以外的区域的核苷酸链进一步，所述核酸适配体a通过与ssdna2连接形成ssdna2-a，再与td相连，所述ssdna2-a的核苷酸序列如seq id no.10所示，其5’端修饰有氨基。
7.进一步，所述多肽p为特异性结合tnfr1的plad的氨基酸链。
8.进一步，所述多肽p的氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.上述的双靶点复合核酸纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）向ssdna2-a或ssdna1溶液中加入交联剂sulfo-smcc，使ssdna2-a或ssdna1与sulfo-smcc的物质的量为1:100，搅拌条件下反应完全，纯化除去过量的交联剂，得中间产
物溶液，经oligonucleide & clean concentrator试剂盒纯化；（2）向步骤（1）的中间产物溶液中加入多肽p粉末，使两者的物质的量为1:10，搅拌条件下反应完全，经oligonucleide & clean concentrator试剂盒纯化除去过量的多肽，得多肽-dna交联产物命名为ssdna2-a-p或ssdna1-p；（3）将s1-t、s2-t、s3-t、s4-t、s5-t、s6-t和核酸适配体a混合均匀，其中各链的终浓度为2.5 μm、a的终浓度为7.5 μm，在95
°
c变性5 min，降温至4
°
c，合成核酸适配体a修饰的td前体；将其与ssdna1-p混匀，降温得到双靶点复合核酸纳米药物td-3a-np。
10.（4）将s1-t、s2-t、s3、s4、s5-t、s6混合均匀，其中各链的终浓度为2.5 μm，在95
°
c变性5 min，降温至4
°
c，合成td前体；将其与a-p混匀，降温得到双靶点复合核酸纳米药物td-n(a-p)。
11.进一步，所述步骤（1）中反应的条件为37
°
c、1200 rpm，ph7-9；步骤（2）中反应的条件为37
°
c、1200 rpm，ph6.5-7.5。
12.进一步，步骤（3）（4）中s1-t序列如seq id no.3所示、s2-t序列如seq id no.4所示、s3-t序列如seq id no.5所示、s4-t序列如seq id no.6所示、s5-t序列如seq id no.7所示、s6-t序列如seq id no.8所示、s3序列如seq id no.11所示、s4序列如seq id no.12所示、s6序列如seq id no.13所示，a序列如seq id no.1所示。
13.上述的双靶点复合核酸纳米药物在制备类风湿性关节炎的药物中的应用。
14.本发明具有以下有益效果：1、本发明中的多肽p为靶向性多肽，核酸适配体和多肽可通过不同的方法修饰到td上，制备具有不同空间结构的双靶点核酸纳米药物td-3a-np和td-n(a-p) 其中（n=1，2或3）。其中，多肽药物p能够与tnfr1的前配体结构域plad结合，阻断tnf α与tnfr1的结合，抑制tnfr1介导的炎症信号通路的激活，从而达到治疗炎症的目的。
15.2、本发明中的适配体a具有靶向性，双靶点复合核酸纳米药物td-3a-np和td-n(a-p)其中（n=1，2或3）可同时特异性作用于tnfr1的不同区域，引起tnfr1下游细胞信号通路的变化，阻断炎症相关的信号通路，实现治疗炎症的目的。
16.3、本发明所构建的核酸适配体a和多肽药物p交联的双靶点复合核酸纳米药物可以同时作用于tnfr1受体，达到双重靶向和双重阻断tnf α信号通路的目的，是一种较好的生物治疗手段，可避免传统化学治疗的毒副作用，有望成为一种新的治疗方法应用于炎症治疗。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为多肽-dna复合物的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中(a) ssdna1-p的表征。泳道1. 50 bp dna ladder; 泳道2. nh
2-ssdna1; 泳道3. ssdna1-p; (b) a-p 的表征。泳道1. 50 bp dna ladder; 泳道2. nh
2-ssdna2-a; 泳道3. a-p。
19.图2为双靶向复合核酸纳米药物td-3a-3p和td-3(a-p)的琼脂糖凝胶电泳表征，其
中(a) td-3a-3p的表征。泳道1. td; 泳道2. td-3a; 泳道3. td-3a-p; 泳道4. td-3a-2p; 泳道5. td-3a-3p; 泳道6. 50 bp dna ladder。(b) td-3(a-p)的表征。泳道1. 50 bp dna ladder; 泳道2. td; 泳道3. td-(a-p); 泳道4. td-2(a-p); 泳道5. td-3(a-p)。
20.图3为复合核酸纳米药物对炎性l929细胞存活率的影响图。
21.图4为复合核酸纳米药物对p-iκb蛋白表达量的影响图。
22.图5为复合核酸纳米药物在cia小鼠体内的治疗效果图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本实验用到的多肽和核酸核心序列如下： 实施例：双靶点复合核酸纳米药物制备与表征1、多肽-dna复合物ssdna1-p、a-p的制备在无菌的离心管中加入ssdna1或ssdna2-a和交联剂sulfo-smcc，使两者反应的摩尔比为1:100，涡旋混合均匀。在37
°
c，1200 rpm条件下反应2 h。纯化除去交联剂，得中间产物。向中间产物中加入抗炎活性肽p，使两者反应的摩尔比为1:10，涡旋均匀，在37
°
c，1200 rpm条件下反应12 h。纯化除去未反应的多肽，即制得多肽-dna复合物ssdna1-p和a-p。
25.所得产物用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。安装垂直电泳装置，检漏10 min。称取4.8 g尿素于50 ml的ep管中，加入2 ml 5
×
tbe电泳液，涡旋混匀，在50
°
c左右的水浴中加热使尿素溶解。冷却后依次加入5 ml 30%的丙烯酰胺溶液、100 μl 10% ap和10 μl temed，快速涡旋混匀。注入到玻璃板之间，制备尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。将样品与3
×
甲酰胺上样缓冲液按照2:1的比例混匀，在pcr仪中95
°
c变性5 min。将样品加入到加样孔中，在120 v电压条件下电泳1 h。电泳结束，将凝胶置于eb溶液中染色，用bio-rad凝胶成像仪进行分析。如图1所示，和游离的dna相比，合成产物的迁移速率减慢，表明多肽-dna复合物ssdna1-p、a-p制备成功（图1）。
26.2、td-3a-np的制备和表征在无菌的pcr管中加入s1-t、s2-t、s3-t、s4-t、s5-t、s6-t，使其终浓度为2.5 μm，加入ssdna2-a，使其终浓度为7.5 μm，混匀，在95
°
c变性5 min，迅速降温至4
°
c，合成a修饰的td；将其和多肽-dna复合物ssdna1-p混匀，从40
°
c缓慢降温至20
°
c，合成双靶点dna复合核酸纳米药物td-3a-3p。所得产物用琼脂糖凝胶电泳表征。如图2a所示，与空白td（泳道1）相比，随着a和p修饰数目的增加，合成产物td-3a、td-3a-p、td-3a-2p、td-3a-3p（泳道2-5）电泳条带迁移速率逐渐减慢，且td-3a-3p的电泳条带迁移速率最慢，说明体系的分子量逐渐增加。各泳道中产物的电泳条带呈现明亮的单一条带，几乎没有杂带，且与理论分子量的位置基本一致，表明复合核酸纳米药物td-3a-np （n=1, 2, 3）成功合成。
27.3、td-n(a-p)的制备和表征将s1-t、s2-t、s3、s4、s5-t、s6加到无菌的pcr管中，使其终浓度为2.5 μm，混匀，在95
°
c变性5 min，迅速降温至4
°
c，合成dna四面体前体；将其和多肽-dna复合物a-p混匀，从40
°
c缓慢降温至20
°
c，合成双靶点dna复合核酸纳米药物td-3(a-p)。所得产物用琼脂糖凝胶电泳表征，结果见图2b。和空白td（泳道2）相比，随着多肽-dna复合物ssdna2-a-p（即a-p）修饰数目的增加，合成产物td-(a-p)、td-2(a-p)、td-3(a-p)的电泳条带（泳道3-5）在琼脂糖凝胶中的迁移速率逐渐减慢，且td-3(a-p)的电泳条带的迁移速率最慢，说明体系的分子量逐渐增加。泳道3-5中主条带明显，为单一条带，且并与理论分子量的位置基本一致，表明复合核酸纳米药物td-n(a-p)（n=1, 2, 3）的合成。
28.应用例：1、双靶点复合核酸纳米药物对炎性l929细胞的抗炎活性研究将复合核酸纳米药物与l929细胞预先孵育1 h，之后加入tnf α使其终浓度为3 ng/ml，在培养箱中继续培养16 h，培养结束，利用cck 8法测定细胞活力。结果见图3。
29.与炎症模型tnf α组相比，apt2-55组、pep4-19组的细胞存活率提高，表明其具有一定的体外抗炎活性。与apt2-55和pep4-19单一对照相比，td-3a-3p组、td-3(a-p)组的细胞存活率提高，且具有显著性差异，表明复合核酸纳米药物td-3a-3p、td-3(a-p)的体外抗炎活性进一步提高。其中，与a+p组相比，td-3a-3p组的细胞存活率提高，且具有显著性差异（p 《0.05），表明复合核酸纳米药物td-3a-3p的体外抗炎活性更好，将apt2-55和pep4-19修饰到td上有利于进一步发挥其抗炎活性。
30.2、双靶点复合核酸纳米药物对p-iκb表达量的影响将复合核酸纳米药物与l929细胞预先孵育1 h，之后加入tnf α使其终浓度为20 ng/ml，刺激5 min，刮取细胞，提取细胞蛋白，利用western blot实验考察p-iκb的表达。如
图4所示，和炎症模型tnf α组相比，td-3a-3p和td-3(a-p)均能抑制p-iκb的表达，进一步说明复合核酸纳米药物具有良好的抗炎活性。
31.3、利用两次免疫法建立cia小鼠模型，并用复合核酸纳米药物td-3a-3p进行治疗，治疗结束取小鼠后爪，进行micro-ct扫描。结果见图5。和model组相比，治疗结束后td-3a-3p组小鼠的后爪骨头表面较为光滑，关节侵蚀程度降低，表明td-3a-3p在cia小鼠体内具有良好的体内抗炎效果。
32.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种核酸适配体和多肽交联的双靶点复合核酸纳米药物，其特征在于：所述双靶点复合核酸纳米药物是通过将核酸适配体a和多肽p以不同的方式修饰到td上得到的。2.根据权利要求1所述的双靶点复合核酸纳米药物，其特征在于：所述核酸适配体a为特异性结合tnfr1中plad以外的区域的核苷酸链，序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的双靶点复合核酸纳米药物，其特征在于：所述核酸适配体a通过与ssdna2连接形成ssdna2-a，再与td相连，其中ssdna2-a的核苷酸序列如seq id no.10所示，其5’端修饰有氨基。4.根据权利要求1所述的双靶点复合核酸纳米药物，其特征在于：所述多肽p为特异性结合tnfr1的plad的氨基酸链。5.根据权利要求4所述的双靶点复合核酸纳米药物，其特征在于：所述多肽p的氨基酸序列如seq id no.2所示。6.权利要求1所述的双靶点复合核酸纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）向ssdna2-a溶液或ssdna1溶液中加入交联剂sulfo-smcc，搅拌条件下反应完全，纯化除去过量的交联剂，得中间产物溶液；（2）向步骤（1）的中间产物溶液中加入多肽p粉末，搅拌条件下反应完全，纯化除去过量的多肽，得多肽-dna交联产物ssdna2-a-p或ssdna1-p；（3）将s1-t、s2-t、s3-t、s4-t、s5-t、s6-t和核酸适配体a混合均匀，在95
°
c变性5 min，降温至4
°
c，合成核酸适配体a修饰的td前体；将其与ssdna1-p混匀，退火得到双靶点复合核酸纳米药物td-3a-np；（4）将s1-t、s2-t、s3、s4、s5-t、s6混合均匀，在95
°
c变性5 min，降温至4
°
c，合成td前体；将其与a-p混匀，退火得到双靶点复合核酸纳米药物td-n(a-p)。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中反应的条件为37
°
c、1200 rpm，ph7-9，交联剂为sulfo-smcc；步骤（2）中反应的条件为37
°
c、1200 rpm，ph6.5-7.5。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：中间产物和多肽p的物质的量比为1：10，n=1，2或3。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：ssdna1序列如seq id no.9所示、s1-t序列如seq id no.3所示、s2-t序列如seq id no.4所示、s3-t序列如seq id no.5所示、s4-t序列如seq id no.6所示、s5-t序列如seq id no.7所示、s6-t序列如seq id no.8所示、s3序列如seq id no.11所示、s4序列如seq id no.12所示、s6序列如seq id no.13所示。10.权利要求1-5任一项所述的双靶点复合核酸纳米药物在制备类风湿性关节炎的药物中的应用。
技术总结本发明属于生物医药技术领域，涉及生物药物递送系统，特别是指一种双靶点复合核酸纳米药物及其制备方法和应用。核酸适配体Apt2-55（A）和多肽Pep4-19（P）可通过不同的方法修饰到DNA四面体（TD）上，制备具有不同空间结构的双靶点复合核酸纳米药物，如TD-3A-3P和TD-3(A-P)。本发明所构建的双靶点复合核酸纳米药物TD-3A-nP和TD-n(A-P)其中（n=1，2或3）可以作用于TNFR1受体的不同部位，达到双重靶向和双重阻断TNF相关信号通路的目的，是一种较好的生物治疗手段，可避免传统化学治疗的毒副作用，有望成为一种新的治疗方法应用于炎症治疗。有望成为一种新的治疗方法应用于炎症治疗。有望成为一种新的治疗方法应用于炎症治疗。
技术研发人员：赵永星 王肖楠 代丽君 孙朋超 张译 杨龙华
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
