1.本发明属于外泌体技术领域，具体涉及一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用。
背景技术：2.人流、刮宫等妇科手术给女性子宫内膜损伤带来了巨大的伤害，导致越来越多的女性不孕不育，妇科疾病频发。干细胞在组织修复与再生医疗方面扮演者重要的角色，已被应用于原发/继发性卵巢早衰和薄型/粘连型子宫内膜的改善治疗中。研究表明，干细胞所发挥的组织修复与再生功能主要是由其旁分泌作用而实现的，而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子，并且外泌体移植规避了干细胞致瘤的缺点，但如何快速制备高活性外泌体并应用于妇科疾病的治疗相关报道甚少。
3.子宫内膜间充质干细胞是子宫内膜再生和修复的种子细胞，能够一定程度上治疗和修复子宫内膜损伤。子宫内膜间充质干细胞通过释放大量的外泌体来构建一个稳态的组织修复的微环境，从而消除炎症反应，促进细胞再生，伤口愈合，修复组织病变。然而，单一细胞来源的外泌体修复作用仍难以满足实际需求。
4.超排卵泡液由血浆渗出物和卵巢局部分泌物组成，由于卵巢血管未穿过卵泡基膜，卵泡液直接提供了颗粒细胞和卵子的生存环境，卵泡液微环境中富含调节卵子发育的激素和相关细胞因子，更有研究已证实，卵泡液外泌体富含rna、mirnas和蛋白，作为通讯媒介，在促进卵泡生长发育(颗粒细胞增殖)、成熟、排卵、闭锁过程中发挥重要的调控作用。人体卵巢和子宫均为受促性腺激素、雌孕激素周期性调节的生殖器官，来自于子宫内膜间充质干细胞和卵泡液的外泌体理论上均可以作为通讯媒介，改善损伤组织的微环境，促进细胞增殖，使损伤子宫内膜获得修复。
5.综上，在现有技术中，例如专利cn108815189a已有对子宫内膜间充质干细胞外泌体制备技术的公开，但是还没有能够联合子宫内膜间充质干细胞外泌体与卵泡液外泌体、并将其应用到妇科疾病治疗、组织病变修复中的报道。
技术实现要素：6.鉴于此，为解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，包括：
9.s1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；
10.1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；将间充质干细胞放入t75细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；
11.1b)收取细胞培养上清液，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡，离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用pbs缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；
12.s2.制备卵泡液外泌体；
13.2a)收集该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；
14.2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；
15.2c)上清液过30kd滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；
16.2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用dpbs缓冲液重悬底部沉淀，获得卵泡液外泌体；
17.s3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；
18.按比例均匀混合步骤s1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤s2制备的卵泡液外泌体，混合后无菌分装并置于-80℃冰箱中冻存；
19.上述制备的复合外泌体主要应用于治疗子宫内膜损伤中，且具体在治疗过程中的使用方式为：
20.每次取3-5ml步骤s3所制备得到的复合外泌体，用dpbs稀释后置于无菌宫腔灌注设备(移植管)内，灌注设备(移植管)将复合外泌体灌注至病灶位置(子宫腔内)。
21.优选的，所述t75细胞培养瓶中的培养基为：用无酚红dmem/f12和体积比浓度为10％代血清做完全培养基。
22.优选的，所述复方电解质注射液采用复方电解质葡萄糖mg3注射液。
23.优选的，在所述步骤s1中，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡的步骤包括：
24.离心去除细胞时，以300g、4℃的条件离心10min，离心后取上清液；
25.离心去除细胞碎片时，以2000g、4℃的条件离心15min，离心后取上清液；
26.离心去除大膜泡时，以10000g、4℃的条件离心30min，离心后取上清液。
27.优选的，在所述步骤s1以及步骤s2中，对所制备得到的外泌体均执行蛋白浓度测定和质量安全实验。
28.优选的，控制所述步骤s1制备得到的子宫内膜间充质干细胞外泌体中蛋白浓度为0.4-0.7mg/ml；控制所述步骤s2制备得到的卵泡液外泌体中蛋白浓度为0.3-0.6mg/ml。
29.优选的，所述质量安全实验包括：外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验。
30.优选的，在所述步骤s3中，所述子宫内膜间充质干细胞外泌体与所述卵泡液外泌体按3-5：1的比例混合。
31.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
32.基于本发明所提供的干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，首次有效实现了子
宫内膜间充质干细胞外泌体与卵泡液外泌体的联合应用；并且，基于本发明制备方法制备得到的复合外泌体具有纯度高、安全高效的优点，对于子宫内膜损伤修复还具有显著的靶向治疗效果。
附图说明
33.图1为本发明实验中对照组的he染色图；
34.图2为本发明实验中模型组的he染色图；
35.图3为本发明实验中治疗组的he染色图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.在本发明中，提供了一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，包括：
38.s1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；
39.1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；将间充质干细胞放入t75细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；
40.1b)收取细胞培养上清液，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡，离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用pbs缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；
41.s2.制备卵泡液外泌体；
42.2a)收集该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；
43.2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；
44.2c)上清液过30kd滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；
45.2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用dpbs缓冲液重悬底部沉淀，获得卵泡液外泌体；
46.s3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；
47.按比例均匀混合步骤s1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤s2制备的卵泡液外泌体，混合后无菌分装并置于-80℃冰箱中冻存。
48.上述制备的复合外泌体主要应用于治疗子宫内膜损伤中，且具体在治疗过程中的
使用方式为：
49.每次取3-5ml步骤s3所制备得到的复合外泌体，用dpbs稀释后置于灌注设备(移植管)内，灌注设备(移植管)将复合外泌体灌注至病灶位置(子宫腔内)
50.实施例1
51.s1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；
52.1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；用无酚红dmem/f12和体积比浓度为10％胎牛血清(选自美国pall公司)做完全培养基，将间充质干细胞放入含有完全培养基的t75细胞培养瓶中，并在37℃、5％co2的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质葡萄糖mg3注射液进行饥饿培养12小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；
53.1b)收取细胞培养上清液并以300g、4℃的条件离心10min(去除细胞)；离心后取上清液并以2000g、4℃的条件离心15min(去除细胞碎片)；离心后取上清液并以10000g、4℃的条件离心30min(去除大膜泡)；离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用pbs缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；
54.对于上述所制备得到的子宫内膜间充质干细胞外泌体执行蛋白浓度测定和质量安全实验；基于蛋白浓度测定，以蛋白浓度为1mg/ml的子宫内膜间充质干细胞外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体；基于质量安全实验，以能合格通过外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验的子宫内膜间充质干细胞外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体。
55.s2.制备卵泡液外泌体；
56.2a)收集50ml该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；
57.2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；
58.2c)上清液过30kd滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；
59.2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用dpbs缓冲液重悬底部沉淀，获得卵泡液外泌体；
60.对于上述所制备得到的卵泡液外泌体执行蛋白浓度测定和质量安全实验；基于蛋白浓度测定，以蛋白浓度为1mg/ml的卵泡液外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体；基于质量安全实验，以能合格通过外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验的卵泡液外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体。
61.s3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；
62.按3：1的比例均匀混合步骤s1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤s2制备
的卵泡液外泌体，混合后无菌分装至1ml的分装瓶中，置于-80℃冰箱中冻存；
63.s4.灌注使用；
64.取3ml步骤s3所制备得到的复合外泌体，用dpbs稀释后置于灌注设备内，灌注设备将复合外泌体灌注至病灶位置。
65.实施例2
66.s1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；
67.1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；用无酚红dmem/f12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，将间充质干细胞放入含有完全培养基的t75细胞培养瓶中，并在37℃、5％co2的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质葡萄糖mg3注射液进行饥饿培养18小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；
68.1b)收取细胞培养上清液并以300g、4℃的条件离心10min(去除细胞)；离心后取上清液并以2000g、4℃的条件离心15min(去除细胞碎片)；离心后取上清液并以10000g、4℃的条件离心30min(去除大膜泡)；离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用pbs缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；
69.对于上述所制备得到的子宫内膜间充质干细胞外泌体执行蛋白浓度测定和质量安全实验；基于蛋白浓度测定，以蛋白浓度为1mg/ml的子宫内膜间充质干细胞外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体；基于质量安全实验，以能合格通过外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验的子宫内膜间充质干细胞外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体。
70.s2.制备卵泡液外泌体；
71.2a)收集50ml该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；
72.2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；
73.2c)上清液过30kd滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；
74.2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用dpbs缓冲液重悬底部沉淀，获得卵泡液外泌体；
75.对于上述所制备得到的卵泡液外泌体执行蛋白浓度测定和质量安全实验；基于蛋白浓度测定，以蛋白浓度为1mg/ml的卵泡液外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体；基于质量安全实验，以能合格通过外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验的卵泡液外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体。
76.s3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；
77.按4：1的比例均匀混合步骤s1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤s2制备
的卵泡液外泌体，混合后无菌分装至1ml的分装瓶中，置于-80℃冰箱中冻存；
78.s4.灌注使用；
79.取4ml步骤s3所制备得到的复合外泌体，用dpbs稀释后置于灌注设备内，灌注设备将复合外泌体灌注至病灶位置。
80.实施例3
81.s1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；
82.1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；用无酚红dmem/f12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，将间充质干细胞放入含有完全培养基的t75细胞培养瓶中，并在37℃、5％co2的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质葡萄糖mg3注射液进行饥饿培养24小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；
83.1b)收取细胞培养上清液并以300g、4℃的条件离心10min(去除细胞)；离心后取上清液并以2000g、4℃的条件离心15min(去除细胞碎片)；离心后取上清液并以10000g、4℃的条件离心30min(去除大膜泡)；离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用pbs缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；
84.对于上述所制备得到的子宫内膜间充质干细胞外泌体执行蛋白浓度测定和质量安全实验；基于蛋白浓度测定，以蛋白浓度为1mg/ml的子宫内膜间充质干细胞外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体；基于质量安全实验，以能合格通过外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验的子宫内膜间充质干细胞外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体。
85.s2.制备卵泡液外泌体；
86.2a)收集50ml该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；
87.2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；
88.2c)上清液过30kd滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；
89.2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用dpbs缓冲液重悬底部沉淀，获得卵泡液外泌体；
90.对于上述所制备得到的卵泡液外泌体执行蛋白浓度测定和质量安全实验；基于蛋白浓度测定，以蛋白浓度为1mg/ml的卵泡液外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体；基于质量安全实验，以能合格通过外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验的卵泡液外泌体为能够被步骤s3使用的外泌体。
91.s3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；
92.按5：1的比例均匀混合步骤s1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤s2制备
的卵泡液外泌体，混合后无菌分装至1ml的分装瓶中，置于-80℃冰箱中冻存；
93.s4.灌注使用；
94.取5ml步骤s3所制备得到的复合外泌体，用dpbs稀释后置于灌注设备内，灌注设备将复合外泌体灌注至病灶位置。
95.针对上述本发明所制备的干细胞与卵泡液复合外泌体，还提供如下实验：
96.a)建立大鼠模型(选用280g左右的雌性sd大鼠为实验对象)
97.其一，子宫内膜损伤模型(后续简称模型组)；采用3％戊巴比妥麻醉模型组大鼠，取仰卧位将模型组大鼠固定于手术板上，于大鼠耻骨联合上1.5cm处作腹部正中纵向切口，暴露大鼠双侧子宫，将一侧子宫近端及远端采用血管夹夹住，于子宫一端使用1ml注射器注入200ul无水乙醇，留针保持宫腔充盈4-5min后，将一侧子宫腔内的无水乙醇抽吸出来，再注射生理盐水冲洗2次，移除血管夹。对侧子宫同样处理后，采用生理盐水冲洗腹腔，逐层关腹。术后注射抗生素预防感染。
98.其二，子宫内膜对照模型(后续简称对照组)；对照组大鼠于双侧子宫注射等量生理盐水，其他操作同上述模型组；
99.其三，子宫内膜复合外泌体治疗模型(后续简称治疗组)；在模型组的子宫内膜损伤造模后3d，再次开腹，在双侧子宫腔内注射1mg/ml本发明所制备的干细胞与卵泡液复合外泌体注射液。
100.b)实验结果检测
101.在术后的30d处死四组大鼠，取子宫进行组织he染色，观察治疗效果。具体结合图1-图3所示可知：
102.以图1对照组为参照，对于图2模型组，其大鼠子宫内膜明显变薄；
103.以图1对照组为参照，对于图3治疗组，其大鼠子宫内膜基底细胞增殖，内膜厚度增加，子宫内膜状态与对照组相似。
104.综上可知，本发明所制备的干细胞与卵泡液复合外泌体能够有效修复子宫内膜损伤。
105.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：1.一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，包括：s1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；将间充质干细胞放入t75细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；1b)收取细胞培养上清液，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡，离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用pbs缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；s2.制备卵泡液外泌体；2a)收集该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；2c)上清液过30kd滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4ml、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用dpbs稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用dpbs缓冲液重悬底部沉淀，使其終体积为浓缩后体积的1/4，获得卵泡液外泌体；s3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；按比例均匀混合步骤s1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤s2制备的卵泡液外泌体，混合后无菌分装并置于-80℃冰箱中冻存。2.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，还包括：s4.宫腔灌注使用；取3-5ml步骤s3所制备得到的复合外泌体，用dpbs稀释后置于无菌宫腔灌注移植注射器内，灌注设备尽可能将复合外泌体灌注至病灶位置。3.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述t75细胞培养瓶中的培养基为：用无酚红dmem/f12和体积比浓度为10％代血清做完全培养基。4.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述复方电解质注射液采用复方电解质葡萄糖mg3注射液。5.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤s1中，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡的步骤包括：离心去除细胞时，以300g、4℃的条件离心10min，离心后取上清液；离心去除细胞碎片时，以2000g、4℃的条件离心15min，离心后取上清液；离心去除大膜泡时，以10000g、4℃的条件离心30min，离心后取上清液。
6.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤s1以及步骤s2中，对所制备得到的外泌体均执行蛋白浓度测定和质量安全实验。7.根据权利要求6所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于：控制所述步骤s1制备得到的子宫内膜间充质干细胞外泌体中蛋白浓度为0.4-0.7mg/ml；控制所述步骤s2制备得到的卵泡液外泌体中蛋白浓度为1mg/ml。8.根据权利要求6所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述质量安全实验包括：外泌体皮下植入实验、眼部刺激实验、亚慢性毒性实验、皮肤过敏实验、皮肤刺激实验、细胞毒性实验、全身毒性实验以及遗传毒性实验。9.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于：在所述步骤s3中，所述子宫内膜间充质干细胞外泌体与所述卵泡液外泌体按3-5：1的比例混合。10.利用权利要求1-9中任意一项所述的制备方法制备得到的干细胞与卵泡液复合外泌体在治疗子宫内膜损伤中的应用。
技术总结本发明属于外泌体技术领域，公开了一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用，其中所述的制备方法包括：S1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；S2.制备卵泡液外泌体；S3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体：按比例均匀混合步骤S1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤S2制备的卵泡液外泌体，混合后无菌分装并置于-80℃冰箱中冻存；综上，本发明首次有效实现了子宫内膜间充质干细胞外泌体与卵泡液外泌体的联合应用；并且，基于本发明制备方法制备得到的复合外泌体具有纯度高、安全高效的优点，对于子宫内膜损伤修复还具有显著的靶向治疗效果。著的靶向治疗效果。著的靶向治疗效果。
技术研发人员：王红燕 周雪 王鹤颖 颜贝
受保护的技术使用者：宁夏医科大学总医院
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2022/7/5
