1.本发明涉及生物技术领域，具体是一种新型葡甘杂聚糖肽及其制备方法与应用。
背景技术：2.化妆品是人们日常生活的必需品。目前市场上的化妆品按功能来分有保湿、美白、防晒、祛痘、抗皱等；化妆品中的活性成分按其来源可分为人工合成和天然来源。近年来，天然活性成份应用于化妆品具有效果明确、毒副作用小等优点。
3.天然多糖类物质有复杂的生物活性和功能。多糖含有大量亲水性基团表现出优异的理化性质，如强吸水性、乳化性、高黏度和良好的成膜性，这些性质决定了多糖具备开发为保湿成分的天然优势。同时研究还表明多糖能广泛地参与细胞的各种生命活动而产生多种生物学功能，如抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗辐射和抗衰老等。因此，天然多糖类化合物在化妆品领域的应用范围也愈加广泛。“青春痘”、“暗疮”或“粉刺”为皮肤毛囊皮脂腺的慢性炎症反应，具有抗炎活性的多糖类化合物或许可以祛痘。祛痘的方法有口服药物制剂及外用药物治疗，这些方法虽然也有一定的效果，但是弊端突出，比如效果不明显，面部易留下疤痕等毒副作用。
4.a-溶血性链球菌(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)33#是从健康人口腔咽喉部位分离得到，通过液体发酵培养，可以获得a-甘露聚糖肽，也称甘露聚糖肽(mannatide)或多抗甲素(polyactin a)，是我国首创的新型免疫增强剂，该甘露聚糖肽的单糖组成是甘露糖和葡萄糖，甘露糖占总比达到90％以上，相对分子质量为4-6万da。研究表明低浓度的a-甘露聚糖肽即可激活机体细胞免疫和体液免疫机能。现有技术中，并未将其应用于祛痘化妆品中，本发明从该菌株的发酵液中分离分子量更小的葡甘杂聚糖肽，并将其用于祛痘化妆品中。
技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型葡甘杂聚糖肽及其制备方法与应用，从a-溶血性链球菌(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)33#发酵液中分离分子量较小的新型葡甘杂聚糖肽，并将其应用于祛痘化妆品中，有效消除人体肌肤表面的红肿情况，并且能够平衡人体肌肤表面的皮脂分泌，从而使得皮肤在修复后能够更加饱满，减小痘印的残留，同时避免肌肤表面出现松垮和毛孔阻塞的情况。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种新型葡甘杂聚糖肽，所述新型葡甘杂聚糖肽的糖链重复结构单元如下：
[0007][0008]
所述新型葡甘杂聚糖肽为a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)的发酵产物，以摩尔比计，所述新型葡甘杂聚糖肽的单糖组成为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖＝8.22:1:6.46，其重均分子量为10045da，分子量分布系数为1.31。
[0009]
一种新型葡甘杂聚糖肽的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
s1、以a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)为生产菌进行液态发酵，得到发酵液；
[0011]
s2、将所述发酵液进行离心，其后对离心得到的上清液进行浓缩，浓缩温度为60-80℃，浓缩时间为2-6h，其后加入浓缩液体积的3-6倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀，将所述沉淀经三氯乙酸和正丁醇混合溶液除蛋白质杂质，其后进行真空冷冻干燥，得到多糖肽粗品；
[0012]
s3、将所述多糖肽粗品加入蒸馏水复溶，其后用截留量为5万道尔顿的膜超滤进行超滤，收集超滤外液，得到第一次超滤外液；
[0013]
s4、将所述第一次超滤外液，用截留量为2万道尔顿的膜超滤进行超滤，收集超滤外液，得到第二次超滤外液；
[0014]
s5、将所述第二次超滤外液，用截留量为1万道尔顿的膜超滤，收集超滤瓶内浓缩液，得到超滤浓缩液；
[0015]
s6、将所述超滤浓缩液用superdex75pg凝胶柱进行分离，得到组份新型葡甘杂聚糖肽。
[0016]
步骤s1中，所述发酵液的ph值保持在1.5-6.0之间。
[0017]
步骤s2中，所述乙醇浓度为60％-99.9％。
[0018]
所述的新型葡甘杂聚糖肽用于祛痘化妆品中。
[0019]
本发明的有益效果是：本发明从所述a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)的发酵液中分离出分子量较小的新型葡甘杂聚糖肽，并将其应用于抗炎祛痘化妆品中，能够有效消除人体肌肤表面的红肿情况；并且具有明显的皮肤保湿效果，且保湿时间较长，4h后保湿效果依旧良好，能够平衡人体肌肤表面的皮脂分泌，从而使得皮肤在修复后能够更加饱满，减小痘印的残留，并且同时避免肌肤表面出现松垮和毛孔阻塞的情况。
附图说明
[0020]
图1为制备实施例1中制得的葡甘杂聚糖肽高效液相色谱的纯度图；
[0021]
图2为制备实施例1中制得的葡甘杂聚糖肽的红外光谱图；
[0022]
图3为制备实施例1中制得的葡甘杂聚糖肽的单糖组成色谱图；
[0023]
图4为制备实施例1中制得的葡甘杂聚糖肽经甲基化修饰产物gc-ms分析总离子流图谱；
[0024]
图5为制备实施例1中制得的葡甘杂聚糖肽的1h nmr；
[0025]
图6为制备实施例1中制得的葡甘杂聚糖肽的13c nmr图谱。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
[0027]
实施例
[0028]
一种新型葡甘杂聚糖肽，所述新型葡甘杂聚糖肽的糖链重复结构单元如下：
[0029][0030]
所述新型葡甘杂聚糖肽为a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)的发酵产物，以摩尔比计，所述新型葡甘杂聚糖肽的单糖组成为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖＝8.22:1:6.46，其重均分子量为10045da，分子量分布系数为1.31；其制备方法，包括以下步骤：
[0031]
s1、将a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)菌种用血平板活化，挑单克隆接种到液体培养基制备种子液，移取5ml种子液接种到200ml发酵培养基中进行培养，在37℃下培养20h，得到发酵液，按此条件批量发酵；所述发酵液的ph值保持在1.5-6.0之间；
[0032]
s2、将所述发酵液进行离心，其后对离心得到的上清液进行浓缩，浓缩温度为60-80℃，浓缩时间为2-6h，其后加入浓缩液体积的4倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀，将所述沉淀用乙醇洗涤三次，再经三氯乙酸和正丁醇混合溶液除蛋白质杂质，其后进行真空冷冻干燥，得到20.1g多糖肽粗品；所述乙醇浓度为60％-99.9％；
[0033]
s3、将10g所述多糖肽粗品加入500ml蒸馏水复溶，搅拌过夜，离心后取上清液用截留量为5万道尔顿的膜超滤进行超滤，收集超滤外液，得到第一次超滤外液；
[0034]
s4、将所述第一次超滤外液，用截留量为2万道尔顿的膜超滤进行超滤，收集超滤外液，得到第二次超滤外液；
[0035]
s5、将所述第二次超滤外液，用截留量为1万道尔顿的膜超滤，收集超滤瓶内浓缩液，得到超滤浓缩液进行真空冷冻干燥，得到葡甘杂聚糖肽粗品；
[0036]
s6、将500mg所述葡甘杂聚糖肽粗品溶解在5ml去离子水中，离心(10000r/min)上清液通过superdex75pg凝胶柱用超纯水洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，每管收集2ml，洗脱液流速控制在0.5ml/min，其后经过硫酸苯酚法显色、酶标仪490nm检测吸光度值并绘制洗
脱曲线，收集主要峰组分，合并后真空冷冻干燥得到0.45g均一的新型葡甘杂聚糖肽。
[0037]
(1)对实施例所得的葡甘杂聚糖肽进行结构鉴定
[0038]
葡甘杂聚糖肽用shodex ohpak sb-804hq分析凝胶柱上的特征图谱如图1所示，其色谱条件为：流动相：0.3m na2so4；流速：0.7ml/min；柱温：35℃；色谱仪：岛津液相色谱仪；检测器：示差检测器；经高效凝胶过滤色谱法(hpgfc)测定葡甘杂聚糖肽的相对分子质量为10045da。
[0039]
取葡甘杂聚糖肽样品约2mg，采用漠化钾压片法测定葡甘杂聚糖肽的红外光谱，结果如图2，3408.01cm-1
是糖肽糖环上0-h的伸缩振动吸收峰，2932.71cm-1
是c-h的伸缩振动吸收峰，1411.73cm-1
和1050.77cm-1
分别为环外和环内的c-0伸缩振动。1654.15cm-1
是0-h的弯曲振动，911.02cm-1
和815.74cm-1
表明有d-甘露糖，说明葡甘杂聚糖肽是一个糖肽类高聚物。
[0040]
取葡甘杂聚糖肽样品约5mg，溶解在0.5mol/l的稀硫酸溶液中，充氮气封管，110℃高温水解3小时，水解液经中和后，用甲醇-pmp溶液进行衍生，衍生化产物用c18柱进行分析，单糖组成分析结果显示，其单糖组成的摩尔比为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖为8.22:1:6.46。
[0041]
称取葡甘杂聚糖肽样品100mg，进行甲基化修饰，修饰产物经完全酸水解后用gc-ms进行分析检测，结果如图4。基于nist质谱数据库匹配，葡甘杂聚糖肽主要的糖苷键链接有：1
→
4-d-rha，t-man，1
→
4-d-man，1
→
3-d-man，1
→
2-d-man，1
→
6-d-man，1
→
3,4-d-man，1
→
2,3-d-man，1
→
2,4-d-man，1
→
3-d-glc，1
→
4,6-d-man，1
→
3,6-d-man，1
→
2,6-d-man，1
→
3,4,6-d-man，1
→
2,3,6-d-glc。按照总离子流图谱峰面积大小，推断1
→
3-d-man，1
→
3,6-d-man，1
→
2,3-d-man，1
→
2,6-d-man为主链，其余为侧链或者端基甘露糖。
[0042]
取葡甘杂聚糖肽冻干品20mg，加d2o 0.5ml溶解，10000r/min离心，上清液并转移到核磁管中，用jeol600m核磁共振仪上，25℃下分别测定一维核磁共振谱，结果如图5和图6所示。图5表示葡甘杂聚糖肽的h nmr图谱，化学位移在5.212ppm被归属于(1
→
4)-a-d-rha的异头氢信号；5.106ppm被归属于(1
→
2,3)-a-d-man的异头氢信号；4.944ppm被归属于(1
→
2,6)-a-d-man的异头氢信号；4.924ppm被归属于t-a-d-man的异头氢信号；4.902被归属于(1
→
2,3,6)
‑‑
a-d-glc；4.848ppm被归属于(1
→
3)-a-d-glc的异头氢信号；4.845ppm被归属于(1
→
4,6)-a-d-man的异头氢信号；4.818ppm被归属于(1
→
3)-a-d-man的异头氢信号；4.713ppm被归属于(1
→
6)-β-d-man的异头氢信号；4.69ppm被归属于(1
→
3,4)-β-d-man的异头氢信号；4.639ppm被归属于(1
→
4)-β-d-man的异头氢信号；4.619ppm被归属于(1
→
3,6)-β-d-man的异头氢信号。图6表示葡甘杂聚糖肽的c nmr图谱，化学位移102.987ppm归属于t-a-d-man的异头碳信号；化学位移102.47ppm归属于(1
→
3,6)-β-d-man的异头碳信号；化学位移102.336ppm归属于(1
→
3)-a-d-man的异头碳信号；化学位移102.19ppm归属于(1
→
2,6)-a-d-man的异头碳信号；化学位移在100.517ppm归属于(1
→
6)-a-d-man的异头碳信号；化学位移在98.162ppm归属于(1
→
3)-a-d-glc的异头碳信号。图5中化学位移在1.077ppm较弱的信号和图6中化学位移在16.747ppm归属于(1
→
4)-a-d-rha上c6的信号。
[0043]
(2)测试实施例制备的葡甘杂聚糖肽的保湿活性
[0044]
提供一种保湿、祛痘凝胶剂，所述凝胶剂包括以下组分：葡甘杂聚糖肽、卡波姆、丙二醇、三乙醇胺和超纯水；所述凝胶剂的组分的按质量百分数计，为5-10％的新型葡甘杂聚
糖肽、1-2.5％的卡波姆、5-10％的丙二醇、1-2％的三乙醇胺、余量为超纯水。葡甘杂聚糖肽凝胶类化妆品的制备方法，包括以下步骤：
[0045]
s1、称取10g葡甘杂聚糖肽，并研磨成细粉，其后加入适量去离子水中，搅拌使其完全溶解，搅拌均匀后得葡甘杂聚糖肽溶液；
[0046]
s2、按表1所示的质量百分数向卡波姆加入去离子水中，搅拌溶解，搅拌均匀后得透明凝胶基质；
[0047]
s3、将所述透明凝胶基质与所述葡甘杂聚糖肽溶液混合搅拌均匀，并加入丙二醇和三乙醇胺，继续搅拌至均匀，得到混合溶液；
[0048]
s4、向所述混合溶液中添加剩余去离子水至全量，搅拌均匀得到葡甘杂聚糖肽凝胶类化妆品。
[0049]
表1：凝胶类化妆品的物料配比
[0050][0051][0052]
所述葡甘杂聚糖肽凝胶类化妆品的评价方法，包括以下步骤：
[0053]
通过皮肤角质层水分含量的测定，证明本发明的葡甘杂聚糖肽对人体皮肤的较好的保湿作用。
[0054]
试验原理：皮肤衰老时表皮角质层变薄，其中的天然保湿因子含量降低，皮肤的水合能力下降，皮肤的水分丧失明显增加，导致细胞皱缩组织萎缩，皮肤逐渐出现细小皱纹。因此，通过对皮肤水分的测定可以在一定程度上反映皮肤衰老的程度和抗衰老产品的功效。
[0055]
实验方法：选择肌肤正常、无化妆品过敏史的受试人群，年龄22-38岁，其中男性10位，女性10位，随机选取其中5位男性和5位女性作为实验组，剩余的作为对照组。室内温度25
±
1℃，湿度50％
±
5％；试验时将面部清洗干净，每人清洗时间相同，待皮肤晾干后选择面颊部4cm
×
4cm皮肤作为测试区域，涂抹护肤产品1.5g。
[0056]
其中，实验组涂抹的护肤产品为所述葡甘杂聚糖肽凝胶类化妆品，对照组涂抹的护肤产品为不含葡甘杂聚糖肽的基质凝胶。
[0057]
测量：在面颊部测试区域，各自涂抹护肤产品10min后开始进行测试。
[0058]
用数字皮肤水分检测仪测定测试区域的皮肤含水量，使用对应护肤产品1h、2h、3h、4h后，分别测定测试区域含水量，分别测试6次，取平均值；实验结果如表2所示。
[0059]
表2皮肤水分含量测定值
[0060][0061]
由表2可以看出，试验组与对照组比较具有明显的皮肤保湿效果，且保湿时间较长，4h后保湿效果依旧良好。
[0062]
(3)测试实施例制备的葡甘杂聚糖肽对痤疮丙酸杆菌的抑制试验
[0063]
现在大家普遍认为痤疮丙酸杆菌在毛囊中的大量繁殖是诱发青春痘并导致青春痘恶化的一个非常重要的因素，因此，研究对痤疮丙酸杆菌的抑制作用是评价产品祛痘功效的一个重要方法。
[0064]
实验方法：
[0065]
(3.1)痤疮丙酸杆菌的培养
[0066]
痤疮丙酸杆菌ab6919购自中国典型培养物种保藏中心，按照菌株培养条件要求，制备bhi培养基，将痤疮丙酸杆菌菌株接种到bhi培养基中，在厌氧发生袋中37℃厌氧培养48h并振摇均匀备用。另取少量菌珠涂于载玻片上，采用革兰染色的方法固定染色，然后将其置于100
×
100的油镜下执行镜检，镜下可见紫色杆菌，微弯呈棒状或杆状，无杂菌生长。
[0067]
(3.2)倍比稀释样品溶液
[0068]
将痤疮丙酸杆菌培养的溶菌溶液稀释100倍(od600约为0.02)，将实施例所制备的葡甘杂聚糖肽配制成200mg/ml的水溶液，对半稀释成100、50.0、25.0和12.5mg/ml的不同浓度样品溶液。
[0069]
(3.3)菌株和药液的培养
[0070]
向无菌96孔板中每孔加入上述稀释的含有痤疮丙酸杆菌的溶液90μl，再加入稀释的样品溶液10μl，使得药物终浓度为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml；以90μl菌液加10μl无菌生理盐水作为阴性对照；阳性对照以临床常用的皮肤消炎药物米诺环素、左氧氟沙星、阿奇霉素、红霉素；将上述标本转移入恒温摇床培养箱37℃，250r/min厌氧培养48h。
[0071]
(3.4)细菌生长情况的检测
[0072]
用酶标仪测定每组试管药物与痤疮丙酸杆菌混合后溶液od600的吸光值。已完全没有光吸收孔的药物浓度作为最小抑制浓度。取没有光吸收的菌液常规行革兰染色后用显微镜检查来证明有无痤疮丙酸杆菌的生长。
[0073]
(3.5)最小抑菌浓度的测定
[0074]
采用平板培养复测的方法检测案例制备的葡甘杂聚糖肽对痤疮丙酸杆菌ab6919的最小抑菌浓度值(mic
50
值)，结果见表3所示。
[0075]
表3：样品mic测试结果
[0076]
受试样品mic
50
值葡甘杂聚糖肽95μg/ml米诺环素9μg/ml左氧氟沙星20μg/ml
阿奇霉素130μg/ml红霉素140μg/ml
[0077]
从以上试验结果可以看出，所述葡甘杂聚糖肽的抑菌浓度值为95μg/ml，证明葡甘杂聚糖肽具有一定的抑制痤疮丙酸杆菌作用，具有一定的祛痘功能。
[0078]
(4)测试实施例制备的葡甘杂聚糖肽的祛痘效果
[0079]
一种保湿、祛痘凝胶剂，所述凝胶剂包括以下组分：葡甘杂聚糖肽、卡波姆、丙二醇、三乙醇胺和超纯水；所述凝胶剂的组分的按质量百分数计，为5-10％的葡甘杂聚糖肽、1-2.5％的卡波姆、5-10％的丙二醇、1-2％的三乙醇胺、余量为超纯水。本实施例的保湿、祛痘凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：
[0080]
s1、称取葡甘杂聚糖肽并研磨成细粉，并按表4所示的质量百分数向其中加入去离子水，搅拌使其完全溶解，得到葡甘杂聚糖肽溶液；
[0081]
s2、按表4所示的质量百分数将卡波姆加入适量去离子水中，搅拌使其溶解，搅拌均匀后得透明凝胶基质；
[0082]
s3、将所述透明凝胶基质与所述葡甘杂聚糖肽溶液混合搅拌均匀，并加入丙二醇和三乙醇胺，继续搅拌至均匀，得到混合溶液；
[0083]
s4、向所述混合溶液中添加剩余去离子水至全量，搅拌均匀得到保湿、祛痘凝胶剂。
[0084]
表4：物料配比
[0085][0086]
测试实验方法：
[0087]
选取脸部出现痘痘，发炎红肿的志愿者40名，年龄在20-40岁，男女各半，随机分成2组，每组10名男性、10名女性。志愿者每日涂抹本实施例制备的抗炎祛痘化妆品1次，1次15min，每周测试一次，连续测试4周，测试期间不得更换或合用其他同类产品。分别用mpa580皮肤弹性测试仪和visia全脸分析仪分别对志愿者进行测试，并观察志愿者脸部的痘痘体积和面积，以及志愿者脸部消肿情况，所得测试结果见表5。
[0088]
表5：保湿、祛痘凝胶剂抗炎、祛痘效果
[0089]
产品名称皮肤消炎效果痘痘体积缩小率皮肤乳酸刺痛程度实施例158％54％1.3实施例273％61％1.1实施例385％75％0.8
[0090]
通过上述试验结果可以看出，本发明添加有葡甘杂聚糖肽的化妆品能够有效消除人体肌肤表面的红肿情况，并且能够平衡人体肌肤表面的皮脂分泌，从而使得皮肤在修复后能够更加饱满，减小痘印的残留，并且同时避免肌肤表面出现松垮和毛孔阻塞的情况。
[0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
技术特征：1.一种新型葡甘杂聚糖肽，其特征在于，所述新型葡甘杂聚糖肽的糖链重复结构单元如下：2.根据权利要求1所述的一种新型葡甘杂聚糖肽，其特征在于：所述新型葡甘杂聚糖肽为a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)的发酵产物，以摩尔比计，所述新型葡甘杂聚糖肽的单糖组成为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖＝8.22:1:6.46，其重均分子量为10045da，分子量分布系数为1.31。3.一种新型葡甘杂聚糖肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、以a-溶血性链球菌33#(streptococcus hemolyticus-a-hemolysis)为生产菌进行液态发酵，得到发酵液；s2、将所述发酵液浓缩后加入乙醇沉淀，离心收集沉淀，得到多糖肽粗品；s3、将所述多糖肽粗品加入蒸馏水复溶，其后进行超滤，收集超滤外液，得到第一次超滤外液；s4、将所述第一次超滤外液再次进行超滤，收集超滤外液，得到第二次超滤外液；s5、将所述第二次超滤外液再次进行超滤，收集超滤瓶内浓缩液，得到超滤浓缩液；s6、将所述超滤浓缩液进行过柱，分离得到组份新型葡甘杂聚糖肽。4.根据权利要求3所述的一种新型葡甘杂聚糖肽的制备方法，其特征在于：步骤s1中，所述发酵液的ph值保持在1.5-6.0之间。5.根据权利要求3所述的一种新型葡甘杂聚糖肽的制备方法，其特征在于：步骤s2中，所述乙醇浓度为60％-99.9％。6.一种新型葡甘杂聚糖肽在化妆品中的应用，其特征在于：将权利要求1-5任意一项所述的新型葡甘杂聚糖肽用于祛痘化妆品中。
技术总结本发明公开了一种新型葡甘杂聚糖肽及其制备方法与应用，所述新型葡甘杂聚糖肽为a-溶血性链球菌33#的发酵产物，采用浓缩、醇沉的方法，以及超滤的方法分离纯化得到均一多糖肽，通过物理和化学的分析鉴定了其的结构；以摩尔比计，所述新型葡甘杂聚糖肽的单糖组成为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖＝8.22:1:6.46，其重均分子量为10045Da，分子量分布系数为1.31；将其应用到祛痘化妆品中，具有明显的保湿效果，且保湿时间较长，对痤疮丙酸杆菌机油抑制效果，达到消炎、祛痘的效果，且能平衡人体肌肤表面的皮脂分泌，使修复后的皮肤能够更加饱满，减小痘印的残留；能避免肌肤表面松垮和毛孔阻塞。能避免肌肤表面松垮和毛孔阻塞。能避免肌肤表面松垮和毛孔阻塞。
技术研发人员：骆俊清 苟小军
受保护的技术使用者：四川奥邦投资有限公司
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/5
