1.本发明涉及观赏植物组织培养技术领域，具体来说是一种细叶朱蕉组培育苗方法及应用。
背景技术：2.细叶朱蕉(cordyline stricta)为龙舌兰科朱蕉属多年生植物，原产热带澳洲，是龙舌兰科朱蕉属的主要栽培园艺种之一。细叶朱蕉株形美观，色彩华丽高雅，具有较好的观赏性，是且细叶朱蕉具有极强的耐旱、耐涝、耐阴、耐晒、耐热、耐瘠等抗逆性，常作庭院、公园、绿化带等观赏植物。世纪80年代我国开始引种，现在我国广东、广西、福建、台湾以及云南等热带及亚热带地区有广泛栽培。
3.由于细叶朱蕉只有在热带地区的老龄植株上才能结籽，使得朱蕉目前繁殖方式为扦插繁殖。但扦插繁殖存在繁殖率低、繁殖周期长、扦插成苗率低等缺点。近年来虽有在龙舌兰科朱蕉属的组培方面有一定的研究报道，但目前还未有细叶朱蕉组培相关的研究报道，而其他朱蕉属组培技术不能应用于细叶朱蕉，因此需要开发一种适用于细叶朱蕉快速繁殖的方法。
技术实现要素：4.本发明的目的是针对现有技术的问题，提供一种细叶朱蕉组培育苗方法及应用，以满足细叶朱蕉快速繁殖的需求。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种细叶朱蕉组培育苗方法，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、愈伤组织分化和丛生芽的生根，具体为：
6.(1)外植体选择与清洁：选择细叶朱蕉幼嫩心叶为外植体，用滴加2～3滴吐温-80的饱和肥皂水溶液漂洗15～20min，自来水冲淋至无残留后，再用流水冲淋20～30min；
7.(2)外植体消毒：洗净的外植体转移至超净工作台内，用75％酒精消毒25～30s，无菌水涮洗2～3次，8％双氧水消毒15～20min，无菌水涮洗3～4次，0.05％升汞溶液消毒10～12min，无菌水涮洗6～8次；
8.(3)愈伤组织诱导：消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，剪成长2～3cm的小段，接种于wpm+2,4-d 0.5～0.8mg/l+naa 0.5～0.8mg/l+kt 1.0～1.5mg/l+活性炭0.3g/l的愈伤诱导培养基中，25
±
2℃暗培养20～30天，后温度不变，每日光照8h、强度1000～2000lux，光暗交替培养15～20天。
9.(4)愈伤组织增殖：诱导出愈伤组织，切成1.0cm2的小块，接种于wpm+naa 0.4～0.6mg/l+cppu 0.1～0.2mg/l+zt 0.2～0.4mg/l的愈伤增殖培养基中，25
±
2℃暗培养15～20天，后温度不变，每日光照8h、强度1000～2000lux，光暗交替培养10～15天；
10.(5)愈伤组织分化：愈伤组织切成1.0cm2的小块，接种于改良wpm+naa0.02～0.05mg/l+6-ba 3.0～4.0mg/l+lfs 0.5～0.6mg/l+br 0.1～0.2mg/l+土豆泥80～100mg/l的愈伤分化培养基中，25
±
2℃每日照光12h、强度2000～3000lux，光暗交替培养50～60天。
11.(6)丛生芽生根：分化出丛生苗除去基部愈伤，接种在1/2wpm+naa 0.1～0.3mg/l+iba 1.0～1.5mg/l+ppp333 0.1～0.2mg/l+活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，温度25
±
2℃，每日光照12h，强度2000～3000lux，光暗交替培养30～40天。
12.发明中，改良wpm为在原wpm培养基上，硝酸铵改为600mg/l，硫酸钾改为800mg/l，四水氯化钙改为44mg/l，其余物质不变。
13.本发明的有益技术效果是：
14.1.本发明是利用组培技术进行细叶朱蕉种苗的生产，属于现代生物技术，是在人工可控环境下进行的工厂育苗，不受气候、季节的限制，可在短期内大量提供相关品质稳定的种苗。
15.2.采用本发明技术方案，使的消毒污染率及消毒死亡率低，初代诱导率高，大大的节省了无菌体系建立的启动时间。
16.3.本发明在愈伤组织增殖阶段，大部分是在暗培养环境下进行的，极大的节省了培养所需的电耗，同时增殖系数可达5.8-6.5。
17.4.利用常规组培植物生长调节剂组合对细叶朱蕉的愈伤分化时存在分化周期长、分化率极低的情况，而本发明在愈伤分化时采用了naa、6-ba、lfs、br以及土豆泥的有机搭配，使细叶朱蕉分化率可达80％以上。
18.5.wpm是目前最为适宜细叶朱蕉生长的基本培养基，但在愈伤组织的分化阶段时，未对wpm培养基进行改良，极易出现白化现象(如图2所示)，而白化进一步发展会使苗枯死，未枯死的苗进行生根后，移栽成活率几乎为零。本发明在愈伤分化时(如图1所示)，在原wpm基础上进行了改良，几乎不产生白化及枯死现象。未出现白化的苗生根后进一步进行驯化(如图3所示)，其驯化成活率近100％(如图4所示)。
附图说明
19.图1是正常分化的细叶朱蕉。
20.图2是采用传统培养方法培养的细叶朱蕉，具有白化现象。
21.图3是本发明培育后驯化结果。
22.图4是本发明培育方法培养的种苗驯化成成苗。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.一种细叶朱蕉组培育苗方法，步骤包括：
26.1.外植体选择与清洁：选择细叶朱蕉幼嫩心叶为外植体，用滴加3滴吐温-80的饱和肥皂水溶液漂洗15min，自来水冲淋至无残留后，再用流水冲淋20min。
27.2.外植体消毒：洗净的外植体转移至超净工作台内，用75％(v/v)酒精消毒25s，无菌水涮洗2次，8％双氧水消毒15min，无菌水涮洗3次，0.05％升汞溶液消毒10min，无菌水涮
洗8次，消毒污染率为22.4％，消毒死亡率为8.7％。
28.3.愈伤组织诱导：消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，剪成长2cm的小段，接种于wpm+2,4-d 0.5mg/l+naa 0.5mg/l+kt 1.0mg/l+活性炭0.3g/l的愈伤诱导培养基中，温度23℃暗培养20天，后温度不变，每日照光8h，光强1000lux的光暗交替下培养20天，愈伤诱导率为84.7％。
29.4.愈伤组织增殖：诱导出愈伤组织，切成1.0cm2的小块，接种于wpm+naa0.4mg/l+cppu 0.1mg/l+zt 0.2mg/l的愈伤增殖培养基中，温度23℃暗培养15天，后温度不变，每日照光8h，光强1000lux的光暗交替下培养10天，愈伤增殖系数为5.9。
30.5.愈伤组织分化：愈伤组织切成1.0cm2的小块，接种于改良wpm+naa0.02mg/l+6-ba 3.0mg/l+lfs 0.5mg/l+br 0.1mg/l+土豆泥80mg/l的愈伤分化培养基中，在温度23℃，每日照光12h，光强2000lux的光暗交替下培养60天，愈伤分化率为99.4％，无白化苗及枯苗出现。
31.其中，改良wpm为在原wpm培养基上，硝酸铵改为600mg/l，硫酸钾改为800mg/l，四水氯化钙改为44mg/l，其余物质不变。
32.6.丛生芽生根：分化出的丛生苗除去基部愈伤，接种在1/2wpm+naa0.1mg/l+iba 1.0mg/l+ppp333 0.1mg/l+活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在温度23℃，每日照光12h，光强2000lux的光暗交替下培养30天，丛生芽生根率为100％。
33.实施例2
34.1.外植体选择与清洁：选择细叶朱蕉幼嫩心叶为外植体，用滴加2滴吐温-80的饱和肥皂水溶液漂洗18min，自来水冲淋至无残留后，再用流水冲淋25min。
35.2.外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台内，用75％(v/v)酒精消毒30s，无菌水涮洗3次，8％双氧水消毒18min，无菌水涮洗4次，0.05％升汞溶液消毒11min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为20.1％，消毒死亡率为10.4％。
36.3.愈伤组织诱导：消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，剪成长3cm的小段，接种于wpm+2,4-d 0.7mg/l+naa 0.6mg/l+kt 1.3mg/l+活性炭0.3g/l的愈伤诱导培养基中，温度25℃暗培养25天，后温度不变，每日照光8h，光强1500lux的光暗交替下培养20天，愈伤诱导率为91.2％。
37.4.愈伤组织增殖：诱导出的愈伤组织切成1.0cm2的小块，接种于wpm+naa0.5mg/l+cppu 0.2mg/l+zt 0.3mg/l的愈伤增殖培养基中，温度25℃暗培养20天，后温度不变，每日照光8h，光强1500lux的光暗交替下培养15天，愈伤增殖系数为6.6。
38.5.愈伤组织分化：愈伤组织切成1.0cm2的小块，接种于改良wpm+naa0.04mg/l+6-ba 3.5mg/l+lfs 0.6mg/l+br 0.2mg/l+土豆泥90mg/l的愈伤分化培养基中，温度25
±
2℃每日照光12h，光强2500lux的光暗交替下培养60天，愈伤分化率为98.9％，有约0.11％白化苗，无枯苗情况发生。
39.其中，改良wpm为在原wpm培养基上，硝酸铵改为600mg/l，硫酸钾改为800mg/l，四水氯化钙改为44mg/l，其余物质不变。
40.6.丛生芽生根：分化出丛生苗，除去基部愈伤，接种在1/2wpm+naa0.2mg/l+iba 1.3mg/l+ppp333 0.1mg/l+活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在温度25℃，每日照光12h，光强2500lux的光暗交替下培养25天，丛生芽生根率为100％。
41.实施例3
42.1.外植体选择与清洁：选择细叶朱蕉幼嫩心叶为外植体，用滴加3滴吐温-80的饱和肥皂水溶液漂洗20min，自来水冲淋至无残留后，再用流水冲淋30min。
43.2.外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台内，用75％(v/v)酒精消毒30s，无菌水涮洗3次，8％双氧水消毒20min，无菌水涮洗4次，0.05％升汞溶液消毒12min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为12.4％，消毒死亡率为14.7％。
44.3.愈伤组织的诱导：消毒好外植体用无菌纸吸去表面水分，剪成长约2.5cm的小段，接种于wpm+2,4-d 0.8mg/l+naa 0.8mg/l+kt 1.5mg/l+活性炭0.3g/l的愈伤诱导培养基中，温度27℃暗培养30天，后温度不变，每日照光8h，光强2000lux的光暗交替下培养15天，愈伤诱导率为87.6％。
45.4.愈伤组织的增殖：诱导出愈伤组织，切成约1.0cm2的小块，接种于wpm+naa0.6mg/l+cppu 0.2mg/l+zt 0.4mg/l的愈伤增殖培养基中，在温度25
±
2℃，暗培养20天，后温度不变，每日照光8h，光强2000lux的光暗交替下培养10天，愈伤增殖系数为6.3。
46.5.愈伤组织分化：愈伤组织切成约1.0cm2的小块，接种于改良wpm+naa0.05mg/l+6-ba 4.0mg/l+lfs 0.6mg/l+br 0.2mg/l+土豆泥100mg/l的愈伤分化培养基中，温度27℃，每日照光12h，光强3000lux的光暗交替下培养60天，愈伤分化率为100％，白化率为0.14％，无枯苗出现。
47.其中，改良wpm为在原wpm培养基上，硝酸铵改为600mg/l，硫酸钾改为800mg/l，四水氯化钙改为44mg/l，其余物质不变。
48.6.丛生芽的生根：分化出丛生苗，除去基部愈伤，接种在1/2wpm+naa0.3mg/l+iba 1.5mg/l+ppp333 0.2mg/l+活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在温度27℃，每日照光12h，光强3000lux的光暗交替下培养40天，丛生芽生根率为100％。
49.实施例1-3培育的得到的生根苗进行田间驯化，未出现白化的苗生根后进一步进行驯化(如图3所示)，其驯化成活率近100％(如图4所示)。
50.最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
技术特征：1.一种细叶朱蕉组培育苗方法，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、愈伤组织分化和丛生芽的生根，其特征在于，具体为：(1)外植体选择与清洁；(2)外植体消毒；(3)愈伤组织诱导：消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，剪成长2～3cm的小段，接种于wpm+2,4-d 0.5～0.8mg/l+naa 0.5～0.8mg/l+kt 1.0～1.5mg/l+活性炭0.3g/l的愈伤诱导培养基中，25
±
2℃暗培养20～30天，后温度不变，每日光照8h、强度1000～2000lux，光暗交替培养15～20天；(4)愈伤组织增殖：诱导出愈伤组织，切成1.0cm2的小块，接种于wpm+naa 0.4～0.6mg/l+cppu 0.1～0.2mg/l+zt 0.2～0.4mg/l的愈伤增殖培养基中，25
±
2℃暗培养15～20天，后温度不变，每日光照8h、强度1000～2000lux，光暗交替培养10～15天；(5)愈伤组织分化：愈伤组织切成1.0cm2的小块，接种于改良wpm+naa 0.02～0.05mg/l+6-ba 3.0～4.0mg/l+lfs 0.5～0.6mg/l+br 0.1～0.2mg/l+土豆泥80～100mg/l的愈伤分化培养基中，25
±
2℃每日照光12h、强度2000～3000lux，光暗交替培养50～60天。(6)丛生芽生根：分化出丛生苗除去基部愈伤，接种在1/2wpm+naa 0.1～0.3mg/l+iba 1.0～1.5mg/l+ppp333 0.1～0.2mg/l+活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，温度25
±
2℃，每日光照12h，强度2000～3000lux，光暗交替培养30～40天。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外植体选择与清洁为：选择细叶朱蕉幼嫩心叶为外植体，用滴加2～3滴吐温-80的饱和肥皂水溶液漂洗15～20min，自来水冲淋至无残留后，再用流水冲淋20～30min。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述外植体消毒为：洗净的外植体转移至超净工作台内，用75％酒精消毒25～30s，无菌水涮洗2～3次，8％双氧水消毒15～20min，无菌水涮洗3～4次，0.05％升汞溶液消毒10～12min，无菌水涮洗6～8次。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(5)中，所述改良wpm为在原wpm培养基上，硝酸铵改为600mg/l，硫酸钾改为800mg/l，四水氯化钙改为44mg/l，其余物质不变。5.根据权利要求1所述方法在细叶朱蕉组培育苗中的应用。
技术总结本发明涉及观赏植物组织培养技术领域，具体来说是一种细叶朱蕉组培育苗方法及应用，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、愈伤组织分化和丛生芽的生根，本发明是利用组培技术进行细叶朱蕉种苗的生产，属于现代生物技术，是在人工可控环境下进行的工厂育苗，不受气候、季节的限制，可在短期内大量提供相关品质稳定的种苗。供相关品质稳定的种苗。供相关品质稳定的种苗。
技术研发人员：王德新 赵露琴 邱旭 曾祥飞 邓国宾 向建英 张媛
受保护的技术使用者：云南植虫药生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.05
技术公布日：2022/7/5
