一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用
技术领域
1.本发明涉及细胞生物学与干细胞技术领域，特别涉及一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用。
背景技术：2.细胞衰老在整个生命周期中都可发生，是机体衰老的基本单位。衰老细胞在形态上表现出细胞结构退行性改变，且伴随基因表达改变、细胞周期停滞、复制能力下降、线粒体改变、功能衰退及代谢减缓。
3.细胞外囊泡(exetracellular vesicles，evs)是细胞分化、活化、衰老、转化等刺激所诱导产生的异质性囊泡，作为一种细胞间通讯的功能性载体，以旁分泌或内分泌方式改变相邻或远处细胞行为，参与维持组织细胞功能和调节细胞内环境稳态，在正常生理过程和疾病病理过程中发挥重要功能。衰老干细胞释放的外泌体与年轻干细胞释放的外泌体具有不同的生物学功能。如：年轻的骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)释放的外泌体能使衰老的造血干细胞恢复活力并更新其功能。
4.mscs在再生医学和组织工程领域被广泛用于干细胞治疗，是关键治疗工具之一。mscs具有自我更新和多系分化的潜能，通过细胞间的相互作用和大量可溶性分子的分泌去发挥抗炎、促增殖、促血管生成、抗纤维化、抗凋亡等功能。在组织工程和细胞治疗中，mscs需要大规模的细胞培养和长时间的体外细胞培养，而干细胞在体外的连续扩张会导致复制性衰老，而且移植后往往不能得到预期的结果。衰老会削弱mscs的分化和免疫抑制优势、影响其正常功能、增加其遗传不稳定性风险，还可通过sasp改变mscs所处的微环境，这一定程度上制约了mscs基础研究、产业化发展与临床应用。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,ipsc)，在体外可定向诱导分化出多种细胞，具有供体的确切遗传背景和多能性，可实现精确的疾病建模、体外药物测试等，具有广阔医疗应用前景。目前，有效延缓/逆转的人类ipsc来源的mscs在体外培养中的复制性衰老仍是推进其临床应用和产业发展亟需解决的关键问题。
5.因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现要素：6.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用，旨在解决现有ipsc-mscs在体外培养易出现复制性衰老的问题。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用。
9.所述的应用，其中，所述细胞外囊泡为第六代ipsc-mscs分泌的细胞外囊泡。
10.所述的应用，其中，所述细胞外囊泡通过促进ipsc-mscs数量增长来缓解ipsc-mscs衰老。
11.所述的应用，其中，所述细胞外囊泡通过促进ipsc-mscs迁移来缓解ipsc-mscs衰老。
12.所述的应用，其中，所述细胞外囊泡通过降低ipsc-mscs线粒体密度来缓解ipsc-mscs衰老。
13.所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡通过改善ipsc-mscs线粒体膜电位状态来缓解ipsc-mscs衰老。
14.有益效果：本发明在体外扩增培养ipsc-mscs过程中，通过在培养体系中加入性能好的骨髓间质干细胞分泌的细胞外囊泡，结果发现其可有效缓解imsc衰老表型。因此本发明提供了一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用，通过采用含有细胞外囊泡的培养基在体外培养ipsc-mscs，能提高ipsc-mscs的产量，更好的维续ipsc-mscs优良性能，有利于推动ipsc-mscs产业化发展和临床应用。
附图说明
15.图1是实施例1中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡形态特征图；
16.图2是实施例1中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡颗粒粒径分析图；
17.图3是实施例1中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡标志蛋白检测结果图；
18.图4是实施例2中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡促进衰老ipsc-mscs细胞数量增长；
19.图5是实施例3中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡有助于衰老ipsc-mscs迁移；
20.图6是实施例4中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡降低了衰老ipsc-mscs的线粒体密度；
21.图7是实施例5中ipsc-mscs来源的细胞外囊泡改善了衰老ipsc-mscs的线粒体膜电位状态。
具体实施方式
22.本发明提供一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
23.本发明提供了一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用。
24.在本发明中，所述细胞外囊泡通过促进ipsc-mscs数量增长、促进ipsc-mscs迁移、降低ipsc-mscs线粒体密度或者改善ipsc-mscs线粒体膜电位状态来缓解ipsc-mscs衰老。
25.优选地，本发明中所述细胞外囊泡为第六代ipsc-mscs分泌的细胞外囊泡。
26.下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
27.实施例1
28.ipsc-mscs来源的ev提取和鉴定
29.1)、ipsc-mscs来源的ev提取：
30.将ipsc来源mscs的第五代细胞传代并接种至t175细胞培养瓶中，使用无血清的hmsc培养基，至于37℃5％co2培养箱中培养。每日收集细胞上清液，更换新鲜培养基，直至细胞汇合度大于90％。
31.将已收集细胞上清液于室温、1000xg离心10min，进行预处理。使用millipore的
ultra-15超滤离心管对细胞上清液进行浓缩，将浓缩产物添加至izon qevoriginal尺寸排阻分离柱中分离得到悬浮于pbs缓冲液中的ev。
32.2)、ipsc-mscs来源的ev形态特征分析
33.取10微升ev悬液样品滴于载样铜网上，滴加1％磷钨酸进行负染，透射电子显微镜下观察并拍摄颗粒物形态。实验结果如图1所示，ev保持正常的球形形状。
34.3)、ipsc-mscs来源的ev颗粒粒径分析
35.取100微升ev悬液样品置于载样器中，使用可视型纳米颗粒分析仪进行粒度分析和浓度检测。实验结果如图2所示，提取的ev颗粒符合国际定义的大小范围。
36.4)、ipsc-mscs来源的ev标志蛋白分析
37.取20微升ev悬液制备蛋白样品，western blot实验检测ev特征性蛋白表达。实验结果如图3所示，提取的ev表达了alix、tsg101、cd81和cd63蛋白，符合国际认可的标准。
38.实施例2
39.ipsc-mscs来源的ev促进衰老ipsc-mscs细胞数量增长
40.分别将适量的第7代、第14代和第23代ipsc-mscs接种到细胞培养板中过夜培养，待细胞汇合度达到50-60％时，向无血清的hmsc培养基中添加ev(2x108颗粒/毫升)，分别在孵育1、2和3天时固定细胞并对细胞核进行染色，使用荧光显微镜拍摄dpai染色情况，运用软件对细胞核进行计算统计。统计结果如图4所示，与对照组(pbs组)相比，ev促进了衰老ipsc-mscs细胞数量增长。
41.实施例3
42.ipsc-mscs来源的ev有助于衰老ipsc-mscs迁移
43.将适量的第7代ipsc-mscs(衰老早期)接种到细胞培养板中培养，待细胞汇合度达到95％后进行划痕实验，并培养基中添加ev(2x108颗粒/毫升)，分别在孵育0、8和24小时进行拍照记录。记录结果如图5所示，与对照组(pbs组)相比，ev一定程度上助于衰老ipsc-mscs迁移。
44.实施例4
45.ipsc-mscs来源的ev影响衰老ipsc-mscs的线粒体数量
46.将适量的第11代ipsc-mscs(衰老后期)接种到细胞培养板中过夜培养，第二天更换含有ev(2x108颗粒/毫升)的新鲜培养基，在孵育1天后对细胞进行线粒体染色，使用荧光显微镜观察并拍摄染色情况。实验结果如图6所示，与对照组(pbs组)相比，ev组中多数细胞的红色荧光信号削减，即ev降低了衰老ipsc-mscs线粒体密度。
47.实施例5
48.ipsc-mscs来源的ev影响衰老ipsc-mscs的线粒体膜电位状态
49.将适量的第11代ipsc-mscs(衰老后期)接种到细胞培养板中过夜培养，第二天更换含有ev(2x108颗粒/毫升)的新鲜培养基，在孵育2天时对细胞进行线粒体膜电位分析(jc-1实验)，使用荧光显微镜观察并拍摄。实验结果如图7所示，与对照组(pbs组)相比，ev组中多数细胞的红色荧光信号增强和绿色荧光信号衰减，即ev改善了衰老ipsc-mscs的线粒体膜电位状态。
50.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保
护范围。
技术特征：1.一种细胞外囊泡在制备缓解ipsc-mscs衰老培养基的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡为第六代ipsc-mscs分泌的细胞外囊泡。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡通过促进ipsc-mscs数量增长来缓解ipsc-mscs衰老。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡通过促进ipsc-mscs迁移来缓解ipsc-mscs衰老。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡通过降低ipsc-mscs线粒体密度来缓解ipsc-mscs衰老。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡通过改善ipsc-mscs线粒体膜电位状态来缓解ipsc-mscs衰老。
技术总结本发明公开了一种细胞外囊泡在制备缓解iPSC-MSCs衰老培养基的应用。本发明在体外扩增培养iPSC-MSCs过程中，通过在培养体系中加入性能好的骨髓间质干细胞分泌的细胞外囊泡，结果发现其可有效缓解iMSC衰老表型。因此本发明提供了一种细胞外囊泡在制备缓解iPSC-MSCs衰老培养基的应用，通过采用含有细胞外囊泡的培养基在体外培养iPSC-MSCs，能提高iPSC-MSCs的产量，更好的维续iPSC-MSCs优良性能，有利于推动iPSC-MSCs产业化发展和临床应用。MSCs产业化发展和临床应用。MSCs产业化发展和临床应用。
技术研发人员：何良格 周光前
受保护的技术使用者：深圳丹伦基因科技有限公司
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
