1.本发明涉及化合物生物制备技术领域，具体涉及一种生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法。
背景技术：2.吡虫啉(imidacloprid，imi)，化学名为1-(6-氯吡啶-3-基甲基)-n-硝基亚咪唑烷-2-基胺，是一种新烟碱类杀虫剂。新烟碱类杀虫剂自上市以来发展迅猛，已经成为全球最常用的一类杀虫剂，在120多个国家被注册和使用，占全球杀虫剂使用量的四分之一，在维持作物产量方面发挥了重要作用。吡虫啉是新烟碱类杀虫剂的首款产品，于1991年上市，由于活性强、抗雨性强且易于种子处理而逐渐成为使用最广泛的新烟碱类杀虫剂之一。然而，新烟碱类化合物的化学性质相对稳定，并且水溶性较高，可以通过多种方式迁移到水生系统中。根据各种研究，吡虫啉在加拿大、美国、西班牙、孟加拉国和中国的地表径流和水生系统中被越来越多地检测到，同时也有多项研究表明吡虫啉会对一些非靶标生物造成严重危害。
3.已有研究表明，imi在环境中的降解途径与5-羟基吡虫啉(5-hydroxy imi)及其脱水产物——烯式吡虫啉(olefin imi)有关，因此5-羟基吡虫啉和烯式吡虫啉的合成，可以为吡虫啉的降解研究提供重要的支持，对其使用后可能造成的环境影响及危害的研究和预防提供样品，具有重要的应用价值。
4.公开号cn113173911a的专利公开了一种化学法合成5-羟基吡虫啉的方法，其合成路线较为繁琐；公开号cn103087955a的专利公开了一种利用假黄单胞菌降解吡虫啉合成5-羟基吡虫啉的方法，但未涉及烯式吡虫啉的合成；公开号cn1763044的专利公开了一种利用微生物转化吡虫啉合成烯式吡虫啉的方法，但均未涉及5-羟基吡虫啉的合成。因此，上述方法各自存在一定的局限性，无法实现在一个合成过程中同时合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉，而分别将两种组分合成的方法，一方面是合成效率低、成本高，另一方面是需要的设备多、步骤多、工艺复杂，能耗高。
技术实现要素：5.针对上述问题，本发明提供一种通过生物合成同时合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，克服现有方法存在的局限性，可实现在一个合成过程中同时合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉。
6.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
7.一种生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，包括以下步骤：
8.(1)将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；
9.(2)在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出菌丝片，并接种到液体培养基中，所述液体培养基为kirk液体培养基；
10.所述kirk液体培养基的组成为：按每升计，包括10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、
1.64g无水乙酸钠、1g tween 80和100mlkirk盐溶液，所述tween 80在振荡培养时加入；
11.所述kirk盐溶液的组成为：按每升计，包括20g kh2po4，5g mgso4·
7h2o，1.3g cacl2·
2h2o，0.01g盐酸硫铵，16.7mlkirk微量元素溶液；
12.所述kirk微量元素溶液的组成为：按每升计，包括9g nitrilotriace，3g mgso4·
7h2o，4.2g mnso4·
h2o，6gnacl，0.6g feso4·
7h2o，1.1g coso4·
7h2o，1.1g znso4·
7h2o，0.6g cacl2·
2h2o，0.06g cuso4·
5h2o，0.11galk(so4)2·
12h2o，0.06g h3bo3，0.07g na2moo4·
2h2o；
13.(3)加入吡虫啉并进行振荡培养；
14.(4)分离培养液并以有机溶剂萃取；
15.(5)上清液浓缩后用硅胶色谱法进行梯度洗脱，硅胶色谱法分离得到的产物再通过制备液相色谱进一步分离纯化，制得所述5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉。
16.优选的，所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂。
17.优选的，步骤(3)所述振荡培养的时间在20d以上。
18.优选的，步骤(4)所述有机溶剂为乙酸乙酯。
19.优选的，步骤(4)所述萃取的方法是：加入与培养液等体积的有机溶剂进行萃取次数3次，合并上层清液。
20.优选的，所述制备液相色谱的色谱柱型号为inertsil c30 s-select 5m 20x 250mm。
21.本发明的有益效果为：
22.1、本发明采用新的技术构思，通过生物合成过程可同时合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉，克服了现有方法存在的局限性，可实现在一个合成过程中同时合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉。其优点一方面是合成效率高、成本低，另一方面是需要的设备少、步骤少、工艺简洁，能耗低。
23.2、本发明采用降解能力高于模式菌的白腐真菌phanerochaete sordida yk-624为转化微生物，利用其独特的生物特性和恰当的工艺条件，可在对吡虫啉的转化降解的生物作用的同时，合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉，其合成方法简便，合成效率高，易于产业化。
附图说明
24.利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
25.图1是本发明实施例所述5-hydroxyl imi样品的ms图；
26.图2是本发明实施例所述5-hydroxyl imi样品的nmr分析图；
27.图3是本发明实施例所述5-hydroxyl imi的结构式(mw：271)；
28.图4是本发明实施例所述olefin imi样品的ms图；
29.图5是本发明实施例所述olefin imi样品的nmr分析图；
30.图6是本发明实施例所述olefin imi的结构式(mw：253)。
具体实施方式
31.以下结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
32.实施例：
33.本发明实施例提供的生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，包括以下步骤：
34.(1)将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养，于4℃冰箱内保存备用；所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂，余量为水；
35.(2)在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出2块直径为10mm的菌丝片，并接种到液体培养基中，所述液体培养基为kirk液体培养基；
36.所述kirk液体培养基的组成为：按每升计，包括10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、1g tween 80和100mlkirk盐溶液，所述tween 80在振荡培养时加入；
37.所述kirk盐溶液的组成为：按每升计，包括20g kh2po4，5g mgso4·
7h2o，1.3g cacl2·
2h2o，0.01g盐酸硫铵，16.7mlkirk微量元素溶液；
38.所述kirk微量元素溶液的组成为：按每升计，包括9g nitrilotriace，3g mgso4·
7h2o，4.2g mnso4·
h2o，6gnacl，0.6g feso4·
7h2o，1.1g coso4·
7h2o，1.1g znso4·
7h2o，0.6g cacl2·
2h2o，0.06g cuso4·
5h2o，0.11galk(so4)2·
12h2o，0.06g h3bo3，0.07g na2moo4·
2h2o；
39.(3)加入吡虫啉，在30℃下培养20d；
40.(4)将静置后液体培养基与白腐真菌分离，向分离后的培养液中加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并上清液；
41.(5)旋转蒸发浓缩上清液，并用硅胶色谱法进行梯度洗脱，硅胶色谱分离得到的产物通过制备液相色谱(色谱柱inertsil c30 s-select 5m 20x 250mm)进一步分离纯化得到5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉。
42.实验例
43.将分离纯化得到的两种产物进行鉴定，参见附图1-2、4-5，通过q-tof-ms法观测到m/z294和m/z 276的峰值，经数据对比，推测分子式分别为c9h
10
cln5nao3和c9h8cln5nao2，即5-hydroxy imi和olefin imi。核磁共振波谱分析1h-nmr与已报道结果一致。
44.表1 5-hydroxyl imi数据比对
[0045][0046]
表2 olefin imi数据比对
[0047][0048]
本发明重点是采用降解能力高于模式菌的白腐真菌phanerochaete sordida yk-624为转化微生物，利用其独特的生物特性和恰当的工艺条件，可在对吡虫啉的转化降解的生物作用的同时，合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉，其合成方法简便，合成效率高，易于产业化。
[0049]
需要特别说明的是，其他实施例中，在本发明记载的组分、配比及工艺参数范围内，具体选择其他的组分、配比或者取值，均可以实现本发明记载的技术效果，故不再一一将其列出。
[0050]
部分参考文献：
[0051]
dai y,yuan s,ge f,chen t,xu s,ni j.2006.microbial hydroxylation ofimidacloprid for the synthesis of highly insecticidal olefin imidacloprid.applied microbiology and biotechnology.71,927
–
934.https://doi.org/10.1007/s00253-005-0223-3
[0052]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实
质和范围。
技术特征：1.一种生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；(2)在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出菌丝片，并接种到液体培养基中，所述液体培养基为kirk液体培养基；所述kirk液体培养基的组成为：按每升计，包括10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、1g tween 80和100mlkirk盐溶液，所述tween 80在振荡培养时加入；所述kirk盐溶液的组成为：按每升计，包括20g kh2po4，5g mgso4·
7h2o，1.3g cacl2·
2h2o，0.01g盐酸硫铵，16.7mlkirk微量元素溶液；所述kirk微量元素溶液的组成为：按每升计，包括9g nitrilotriace，3g mgso4·
7h2o，4.2g mnso4·
h2o，6gnacl，0.6g feso4·
7h2o，1.1g coso4·
7h2o，1.1g znso4·
7h2o，0.6g cacl2·
2h2o，0.06g cuso4·
5h2o，0.11galk(so4)2·
12h2o，0.06g h3bo3，0.07g na2moo4·
2h2o；(3)加入吡虫啉并进行振荡培养；(4)分离培养液并以有机溶剂萃取；(5)上清液浓缩后用硅胶色谱法进行梯度洗脱，硅胶色谱法分离得到的产物再通过制备液相色谱进一步分离纯化，制得所述5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉。2.根据权利要求1所述的生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，其特征在于，所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂。3.根据权利要求1所述的生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，其特征在于，步骤(3)所述振荡培养的时间在20d以上。4.根据权利要求1所述的生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，其特征在于，步骤(4)所述有机溶剂为乙酸乙酯。5.根据权利要求1所述的生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，其特征在于，步骤(4)所述萃取的方法是：加入与培养液等体积的有机溶剂进行萃取次数3次，合并上层清液。6.根据权利要求1所述的生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，其特征在于，所述制备液相色谱的色谱柱型号为inertsil c30 s-select 5m 20x250mm。
技术总结本发明属于化合物的生物制备技术领域，公开了一种生物合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉的方法，包括以下步骤：(1)将白腐真菌YK-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；(2)在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出菌丝片，并接种到Kirk液体培养基中；(3)加入吡虫啉并进行振荡培养；(4)分离培养液并以有机溶剂萃取；(5)上清液浓缩后依次用硅胶色谱法和制备液相色谱进一步分离纯化制得。本发明重点是采用白腐真菌YK-624对吡虫啉的转化降解作用同时，合成5-羟基吡虫啉和olefin吡虫啉，该合成方法简便，合成效率高，成本低。本低。本低。
技术研发人员：王剑桥 张格 殷茹
受保护的技术使用者：广州大学
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
