1.本发明涉及悬浮细胞检测技术领域，具体涉及一种悬浮细胞孵育染色方法及免疫荧光检测方法。
背景技术：2.悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮生长状态的细胞。
3.常规悬浮细胞免疫荧光的染色方法流程顺序为：固定，清洗，涂片，风干或者烘干，再次清洗，通透，清洗，加封闭液，加一抗，清洗，加二抗，清洗，加dapi，清洗，封片晾干。整个悬浮细胞的染色流程需要涂片、风干、细胞通透等步骤，试验时间长，效率低。
技术实现要素：4.基于此，有必要提供一种悬浮细胞孵育染色方法及免疫荧光检测方法，不仅能够缩短试验时间，还能够提升悬浮细胞的荧光检测效果。
5.本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供一种悬浮细胞孵育染色方法，包括如下步骤：
7.s1，固定：采用多聚甲醛对悬浮细胞进行固定，采用pbs缓冲液清洗。
8.s2，一抗孵育：采用山羊血清稀释一抗，加入到步骤s1离心清洗好的悬浮细胞中，吹打使细胞重悬，置于37℃恒温摇床中孵育0.5～1.5h，离心沉淀，弃上清，采用pbs缓冲液清洗沉淀细胞。
9.s3，二抗孵育：采用pbs缓冲液稀释荧光二抗，加入并使步骤s2离心清洗后的沉淀细胞重悬，37℃恒温摇床中孵育0.5～1.5h，离心沉淀，弃上清，采用pbs缓冲液清洗沉淀细胞。
10.s4，dapi染核：向步骤s3离心清洗后的沉淀细胞中加入dapi染液，吹打使沉淀细胞重悬，常温避光孵育4～10min，离心沉淀细胞，弃上清，采用pbs缓冲液清洗沉淀细胞。
11.s5，封片：向步骤s4中离心清洗后的沉淀细胞中加入pbs缓冲液，吹打使沉淀细胞重悬均匀，得细胞悬液；在载玻片上滴加抗荧光封片剂，再滴加细胞悬液至抗荧光封片剂中，盖上盖玻片，避光静置晾干，得待检样品。
12.在其中一些实施例中，所述山羊血清的含量为10％。
13.优选地，步骤s2和步骤s3中，37℃恒温摇床中孵育1h。
14.优选地，每个步骤中，采用pbs缓冲液清洗的次数为3～4次。
15.优选地，在步骤s4中细胞悬液的体积为80～120μl，在载玻片上滴加30μl抗荧光封片剂，再滴加30μl细胞悬液至抗荧光封片剂中。
16.在其中一些实施例中，所述悬浮细胞选自nr8383、u266、大鼠神经干细胞。
17.本发明还提供一种悬浮细胞免疫荧光检测方法，包括如下步骤：按照上述悬浮细胞孵育染色方法制备待检样品；镜检。
18.本发明的有益效果为：
19.与现有技术相比，本发明悬浮细胞孵育染色方法仅依次通过固定、一抗孵育、二抗孵育、dapi染核以及封片的步骤就能够实现对悬浮细胞的通透染色，减少了涂片、风干/烘干、细胞通透等实验环节，可以有效节省试验时间，同时避免风干/烘干对实验背景的较大影响，增强溶液对细胞的渗透效果。
附图说明
20.图1为实施例1的nr8383细胞的免疫荧光检测图片。
21.图2为对比例1的nr8383细胞的免疫荧光检测图片。
22.图3为实施例2的u266细胞的免疫荧光检测图片。
23.图4为对比例2的u266细胞的免疫荧光检测图片。
24.图5为实施例3的u266细胞的免疫荧光检测图片。
25.图6为对比例3的u266细胞的免疫荧光检测图片。
26.图7为实施例4的大鼠神经干细胞的免疫荧光检测图片。
27.图8为对比例4的大鼠神经干细胞的免疫荧光检测图片。
28.图9为实施例5的鼠肺泡巨噬细胞的免疫荧光检测图片。
29.图10为对比例5的鼠肺泡巨噬细胞的免疫荧光检测图片。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
31.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
32.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.实施例1
34.本实施例提供一种改进的nr8383细胞孵育染色检测方法，包括如下步骤：
35.s1，固定：
36.采用4％多聚甲醛对nr8383细胞进行固定15min，采用pbs缓冲液(ph值为7～7.4)离心清洗3次，每次离心条件参数为：1500r/min离心3min。
37.s2，一抗孵育：
38.直接采用10％山羊血清稀释一抗(cav1.3)，加入到步骤s1离心清洗好的沉淀细胞中，吹打使沉淀细胞重悬，置于37℃恒温摇床中孵育1h，离心沉淀，弃上清，采用pbs缓冲液(ph值为7～7.4)清洗沉淀细胞，清洗3次，每次离心条件参数为：1500r/min离心3min。
39.s3，二抗孵育：
40.采用pbs缓冲液(ph值为7～7.4)按照1:100稀释荧光二抗(山羊抗兔cy3)，加入并使步骤s2离心清洗后的沉淀细胞重悬(轻轻吹打匀)，37℃恒温摇床中孵育1h，离心沉淀，弃上清，采用pbs缓冲液(ph值为7～7.4)清洗沉淀细胞，清洗3次，每次离心条件参数为：
1500r/min离心3min。
41.s4，dapi染核：
42.向步骤s3离心清洗后的沉淀细胞中加入稀释dapi染液200μl，吹打使沉淀细胞重悬，常温避光孵育5min。
43.离心沉淀细胞，弃上清，采用pbs缓冲液(ph值为7～7.4)清洗沉淀细胞，清洗3次，每次离心条件参数为：1500r/min离心3min。
44.s5，封片：
45.向步骤s4中离心清洗后的沉淀细胞中加入pbs缓冲液(ph值为7～7.4)100μl，吹打使沉淀细胞重悬均匀，得细胞悬液；在载玻片上滴加30μl抗荧光封片剂，再滴加30μl细胞悬液至抗荧光封片剂中，盖上盖玻片，避光静置晾干，得待检样品。
46.s6，荧光检测：
47.将步骤s5待检样品置于奥林巴斯bx53显微镜配dp74相机荧光成像设备上，曝光检测，检测条件参数为：曝光时间为1/7秒，得荧光图片，如图1所示。
48.对比例1
49.本对比例采用常规悬浮细胞免疫荧光的染色方法流程对nr8383细胞细胞进行制样检测，采用与实施例1相同的一抗、二抗、检测设备及曝光条件，结果如图2所示。
50.与图2相比，实施例1改进的nr8383细胞孵育染色检测方法不仅节省试验步骤及时间，同时可以提升检测效果，尤其是实验背景提升明显。
51.实施例2
52.本实施例提供一种改进的u266细胞孵育染色检测方法，其工艺流程步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：一抗为ras，荧光二抗为山羊抗小鼠fitc，曝光检测条件参数为：曝光时间为1/4秒。结果如图3所示。
53.对比例2
54.本对比例采用常规悬浮细胞免疫荧光的染色方法流程对u266细胞进行制样检测，采用与实施例2相同的一抗、荧光二抗、检测设备及曝光条件，结果如图4所示。
55.由图4和图3可以看出，实施例2改进的u266细胞孵育染色检测方法不仅节省试验步骤及时间，同时可以提升检测效果，尤其是实验背景提升明显。
56.实施例3
57.本实施例提供一种改进的u266细胞孵育染色检测方法，其工艺流程步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：一抗为mmsa，荧光二抗为山羊抗兔fitc，检测条件参数为：曝光时间为1/10秒。结果如图5所示。
58.对比例3
59.本对比例采用常规悬浮细胞免疫荧光的染色方法流程对u266细胞细胞进行制样检测，采用与实施例3相同的检测设备及曝光条件，结果如图6所示。
60.由图6和图5可以看出，实施例3改进的u266细胞孵育染色检测方法不仅节省试验步骤及时间，同时可以提升检测效果，尤其是实验背景提升明显。
61.实施例4
62.本实施例提供一种改进的大鼠神经干细胞孵育染色检测方法，其工艺流程步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：一抗为nestin，荧光二抗为山羊抗兔fitc，曝光检测条件参
数为：1/4秒。结果如图7所示。
63.对比例4
64.本对比例采用常规悬浮细胞免疫荧光的染色方法流程对大鼠神经干细胞进行制样检测，采用与实施例4相同的检测设备及曝光条件，结果如图8所示。
65.由图8和图7可以看出，实施例4改进的大鼠神经干细胞孵育染色检测方法不仅节省试验步骤及时间，同时可以提升检测效果，尤其是实验背景提升明显。
66.实施例5
67.本实施例提供一种改进的大鼠肺泡巨噬细胞孵育染色检测方法，其工艺流程步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：一抗为pink1，荧光二抗为山羊抗兔fitc，曝光检测条件参数为：曝光时间为1/41秒。结果如图9所示。
68.对比例5
69.本对比例采用常规悬浮细胞免疫荧光的染色方法流程对大鼠肺泡巨噬细胞进行制样检测，采用与实施例5相同的检测设备及曝光条件，结果如图10所示。
70.由图10和图9可以看出，实施例5改进的大鼠肺泡巨噬细胞孵育染色检测方法不仅节省试验步骤及时间，同时可以提升检测效果，尤其是实验背景提升明显。
71.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种悬浮细胞孵育染色方法，其特征在于，包括如下步骤：s1，固定：采用多聚甲醛对悬浮细胞进行固定，采用pbs缓冲液清洗；s2，一抗孵育：采用山羊血清稀释一抗，加入到步骤s1离心清洗好的悬浮细胞中，吹打使细胞重悬，置于37℃恒温摇床中孵育0.5～1.5h，离心沉淀，弃上清，采用pbs缓冲液清洗沉淀细胞；s3，二抗孵育：采用pbs缓冲液稀释荧光二抗，加入并使步骤s2离心清洗后的沉淀细胞重悬，37℃恒温摇床中孵育0.5～1.5h，离心沉淀，弃上清，采用pbs缓冲液清洗沉淀细胞；s4，dapi染核：向步骤s3离心清洗后的沉淀细胞中加入dapi染液，吹打使沉淀细胞重悬，常温避光孵育4～10min，离心沉淀细胞，弃上清，采用pbs缓冲液清洗沉淀细胞；s5，封片：向步骤s4中离心清洗后的沉淀细胞中加入pbs缓冲液，吹打使沉淀细胞重悬均匀，得细胞悬液；在载玻片上滴加抗荧光封片剂，再滴加细胞悬液至抗荧光封片剂中，盖上盖玻片，避光静置晾干，得待检样品。2.根据权利要求1所述的悬浮细胞孵育染色方法，其特征在于，所述山羊血清的含量为10％。3.根据权利要求1所述的悬浮细胞孵育染色方法，其特征在于，步骤s2和步骤s3中，37℃恒温摇床中孵育1h。4.根据权利要求1所述的悬浮细胞孵育染色方法，其特征在于，每个步骤中，采用pbs缓冲液清洗的次数为3～4次。5.根据权利要求1所述的悬浮细胞孵育染色方法，其特征在于，在步骤s4中细胞悬液的体积为80～120μl，在载玻片上滴加30μl抗荧光封片剂，再滴加30μl细胞悬液至抗荧光封片剂中。6.根据权利要求1至5任一项所述的悬浮细胞孵育染色方法，其特征在于，所述悬浮细胞选自nr8383、u266、大鼠神经干细胞。7.根据权利要求1至5任一项所述的悬浮细胞孵育染色方法，每个步骤中，离心的转速均为1500r/min，时间3min。8.一种悬浮细胞免疫荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：按照权利要求1至7任一项所述的悬浮细胞孵育染色方法制备待检样品；镜检。
技术总结本发明提供一种悬浮细胞孵育染色方法及荧光检测方法，该孵育染色方法包括如下步骤：S1，固定；S2，一抗孵育；S3，二抗孵育；S4，DAPI染核；S5，封片，得待检样品。该孵育染色方法的整染色流程不需要涂片、风干、细胞通透等步骤，试验时间缩短，效率高，提高荧光信噪比，且能够保持甚至提升曝光效果。持甚至提升曝光效果。持甚至提升曝光效果。
技术研发人员：冷毅斌 吴娟 吴亭 牟涛
受保护的技术使用者：武汉巴菲尔生物技术服务有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/7/5
