一种基于16SrRNA扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法

一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法
技术领域
1.本发明涉及土壤生物学及生物信息学领域，具体是通过构建植物和人畜致病细菌非冗余数据库，针对高通量测序数据比对注释实现土壤-植物生态系统中致病细菌生物污染的精准识别与定量。


背景技术：

2.随着人类活动影响的加剧，集约化的土地利用方式使得土传植物致病菌及人畜共患病原体的种类和数量不断增加，严重威胁农业生产及人类健康。当前对致病菌的检测方法主要有pcr法及基因组分析方法。然而，pcr法虽具有靶向性强、应用广泛的优势，但受限于引物的种类数量且易出现假阳性。此外，基因组测序可精准识别致病菌携带的耐药基因和毒力基因，但其测序价格昂贵且需花费的时间较长。而针对细菌16s rrna基因的高通量测序具有检测特异度高、测序成本低等优点，可基于较为齐全的silva数据库进行物种注释。而且该测序方法在生物多样性和群落生态学领域已发表大量研究论文，所获结果具有可靠保障。然而，当前针对致病细菌的检测才刚刚起步。有研究采用探针类方法进行检测，但对操作人员的要求较高、仅能检测307种病原菌。而通过16s扩增子测序方法的仅收集300种临床致病菌建库检测，尚缺乏对土壤-植物生态系统致病细菌进行检测的方法。因此，构建一种基于高通量测序检测土壤致病细菌的新方法，一次性可检测上千种致病菌，为土壤-植物生态系统病原污染的靶向消减及维护全球一体化健康提供重要方法技术，具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，通过网络和文献资源手段，获得当前较为齐全的细菌致病菌库，并通过比对最新silva16s细菌数据库的序列资源，构建了土壤非冗余致病菌数据库用于高通量测序分析，从而实现基于16s rrna基因测序分析快速准确检测土壤致病细菌丰度及组成特征，为消减土壤-植物生态系统病原污染提供研究技术及策略。
4.本发明采取的技术方案是：一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其包括以下步骤：
5.步骤一、构建土壤非冗余致病细菌数据库；
6.步骤二、完成对土壤/植物样品dna的提取；
7.步骤三、完成样品的16s rrna基因测序，获得测序下机数据；
8.步骤四、采用dada2分析流程封装土壤非冗余致病细菌库，获得代表性序列；dada2不再以相似度聚类，而是通过降噪得到不含扩增与测序错误且不含嵌合体的生物学序列，聚类准确率优于传统聚类方法。因此，通过将dada2流程得到的代表性序列与土壤非冗余致病细菌数据库进行比对注释，可精准检测识别样品中的致病细菌丰度及群落多样性特征。
9.步骤五、将代表性序列与土壤非冗余致病菌数据库比对注释致病细菌，得到最终的asv物种表。
10.进一步的，所述步骤二中，通过fastdna试剂盒完成对土壤/植物样品dna的提取；所述步骤三中，利用illumina pe250测序平台完成样品的16s rrna基因测序。
11.进一步的，所述步骤四中，采用dada2流程对测序下机数据进行包括去除接头、质控、降噪、合并双端、去除嵌合体的步骤处理，获取代表性序列。
12.进一步的，所述步骤五中，通过uclust软件，设置相似度阈值为》＝90％，将代表性序列与土壤非冗余致病细菌数据库比对注释致病细菌，得到asv物种表。
13.进一步的，在步骤五之后，通过r语言对asv物种表中不同样品的致病细菌组成、多样性特征进行可视化作图。
14.更进一步的，通过r语言将asv物种表进行丰度、多样性指数的计算及可视化，以进一步明确样品中致病细菌的多样性特征；在计算致病细菌丰度时，对注释到致病细菌的asv丰度作对数变换；
15.pr＝log
10
∑p
sum
16.h＝-∑pi(ln pi)
17.其中pr表示致病菌丰度，h代表多样性指数，p
sum
表示样本中致病细菌asv的绝对丰度数量，pi表示样品中属于第i种个体的比例，如样品总个体数为n，第i种个体数为ni，则pi＝ni/n，各种之间，个体分配越均匀，h值就越大；如果每一个体都属于不同的种，多样性指数就最大；如果每一个体都属于同一种，则其多样性指数就最小。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
19.(1)传统致病菌检测为细菌分离培养和血清学方法，但耗时长、操作繁琐及灵敏度低，培养时间一般需7天以上。本发明无需分离培养，直接通过dna序列识别致病菌，可大幅度缩减检测时间和提高灵敏度。
20.(2)pcr扩增法可以简单、快速检测致病菌，但受限于病原菌检测种类和易受到微量污染而导致假阳性等弊端，通常需要3次以上的重复验证。本发明基于高通量测序分析流程，一次可获得海量物种数据，能快速、精准检测致病菌。
21.(3)基因芯片法可一次性检测307种致病菌，但需设计特异性探针，检测的致病菌种类受限于探针数量。而本发明针对细菌共有的16s rrna基因进行扩增，并基于所构建的土壤非冗余致病细菌数据库进行注释，一次性可检测上千种致病菌。
22.(4)基因芯片法还会受到芯片规格和样品污染的影响。受芯片规格的限制，该方法一次性只能检测数量少于5的样品。且样品受到污染后，易出现假阳性和假阴性。而本发明基于高通量测序平台，不仅一次性可对大规模样品进行检测，而且不易受到样品污染的影响。
23.(5)本发明基于自建土壤非冗余致病细菌数据库。当前具有大量基于16s扩增子测序的物种组成特征研究，然而对致病菌信息的研究仍较为缺乏。此外，本数据库还可根据致病菌的深入研究而不断升级，因而可实现快速、全面、准确检测致病菌的目标。
24.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
25.图1是土壤致病细菌检测流程图。
26.图2是致病细菌数据库结构简图。
27.图3是实施例样品中致病细菌asv物种表。
28.图4是实施例的示例一中发病与健康土致病菌比较；其中，a是发病与健康土致病菌丰度的比较；b是发病与健康土致病菌多样性的比较。
29.图5是实施例的示例二中不同处理致病菌的丰度对比与物种组成情况；其中，a是不同处理致病菌丰度的对比；b是不同处理致病菌的物种组成情况。
具体实施方式
30.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照仪器制造商所建议的条件进行。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。
31.如图1和2，本发明提供了一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，包括以下具体步骤：
32.(1)基于网络资源和文献方式构建土壤非冗余致病细菌数据库；
33.(2)通过fastdna试剂盒完成对土壤/植物样品dna的提取；
34.(3)利用illumina pe250测序平台(基因组dna抽提、pcr扩增、荧光定量、illumina pe250文库构建、illumina pe250测序)完成样品的16s rrna基因测序，获得测序下机数据；
35.(4)采用dada2流程对测序下机数据进行去除接头(引物、barcode)、质控(过滤尾部质量低于20的碱基)、降噪(校正测序和扩增错误)、合并双端并去除嵌合体等步骤，获取代表性序列；
36.(5)通过uclust软件(默认相似度阈值为》＝80％)，设置相似度阈值为》＝90％，将代表性序列与土壤非冗余致病细菌数据库比对注释致病细菌，得到asv物种表；
37.(6)通过r语言对asv物种表中不同样品的致病细菌组成、多样性特征等进行可视化作图。
38.下面结合具体实例作进一步说明：
39.本实施例的示例一来自湖南长沙的12份长期遭受青枯菌发病土壤及12份健康土壤，每个地区的土壤分别执行diseased(发病土壤组)与healthy(健康土壤组)。示例二采用室内温室番茄盆栽试验，处理分为接种致病菌(diseased)和无菌水处理(healthy)，在接种致病菌4周后(发病状况稳定)，分别采集发病及健康的根际土。示例一和示例二共同实施土壤致病细菌检测的新方法，包括以下具体步骤：
40.土壤非冗余致病菌数据库的构建。通过收集21份有致病菌出处的论文/数据库网站中所有种水平致病细菌拉丁名，去冗余后与silva物种库比对得到相应的亚种及strain信息。
41.样品dna的提取和建库测序。采用fastdna试剂盒完成对土壤样品dna的提取，随后利用illumina pe250测序平台完成样品的16s rrna基因测序，获得测序下机数据。
42.采用dada2分析流程封装土壤非冗余致病细菌数据库。对测序下机数据进行去除接头、质控、降噪、合并双端、去除嵌合体等步骤后，获得代表性序列。随后将代表性序列与
土壤非冗余致病菌数据库比对，比对方法采用uclust，参数设置相似性》＝90％，将注释上的物种回贴序列表，得到最终的asv物种表。
43.最终得到的asv物种表结果如图3。对示例一中发病土与健康土中致病菌多样性特征比较如图4。不同处理下的丰度及物种组成比较，结果如图5。
44.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的普通技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明的保护范围，凡采用等同替换等方式所获得的技术方案，均落于本发明的保护范围内。
45.本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、构建土壤非冗余致病细菌数据库；步骤二、完成对土壤/植物样品dna的提取；步骤三、完成样品的16s rrna基因测序，获得测序下机数据；步骤四、采用dada2分析流程封装土壤非冗余致病细菌库，获得代表性序列；步骤五、将代表性序列与土壤非冗余致病菌数据库比对注释致病细菌，得到最终的asv物种表。2.根据权利要求1所述的一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其特征在于，所述步骤二中，通过fastdna试剂盒完成对土壤/植物样品dna的提取；所述步骤三中，利用illumina pe250测序平台完成样品的16s rrna基因测序。3.根据权利要求1所述的一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其特征在于，所述步骤四中，采用dada2流程对测序下机数据进行包括去除接头、质控、降噪、合并双端、去除嵌合体的步骤处理，获取代表性序列。4.根据权利要求1所述的一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其特征在于，所述步骤五中，通过uclust软件，设置相似度阈值为>＝90％，将代表性序列与土壤非冗余致病细菌数据库比对注释致病细菌，得到asv物种表。5.根据权利要求1所述的一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其特征在于，在步骤五之后，通过r语言对asv物种表中不同样品的致病细菌组成、多样性特征进行可视化作图。6.根据权利要求5所述的一种基于16srrna扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其特征在于，通过r语言将asv物种表进行丰度、多样性指数的计算及可视化，以进一步明确样品中致病细菌的多样性特征；在计算致病细菌丰度时，对注释到致病细菌的asv丰度作对数变换；pr＝log
10
σp
sum
h＝-∑p
i
(ln p
i
)其中pr表示致病菌丰度，h代表多样性指数，p
sum
表示样本中致病细菌asv的绝对丰度数量，p
i
表示样品中属于第i种个体的比例，如样品总个体数为n，第i种个体数为ni，则p
i
＝ni/n，各种之间，个体分配越均匀，h值就越大；如果每一个体都属于不同的种，多样性指数就最大；如果每一个体都属于同一种，则其多样性指数就最小。

技术总结
本发明公开了一种基于16SrRNA扩增子测序检测土壤致病细菌生物污染的方法，其包括步骤为：步骤一、构建土壤非冗余致病细菌数据库；步骤二、完成对土壤/植物样品DNA的提取；步骤三、完成样品的16S rRNA基因测序，获得测序下机数据；步骤四、采用DADA2分析流程封装土壤非冗余致病细菌库，获得代表性序列；步骤五、将代表性序列与土壤非冗余致病菌数据库比对注释致病细菌，得到最终的ASV物种表，通过R语言对ASV物种表中不同样品的致病细菌组成、多样性特征等进行可视化作图。本发明能快速、精准检测致病菌，且不易受到样品污染的影响，可而可实现快速、全面、准确检测致病菌的目标。准确检测致病菌的目标。准确检测致病菌的目标。


技术研发人员：江高飞 韦中 杨欣润 徐阳春 沈其荣
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2022/7/5