1.本发明属于生物医学材料技术领域，特别涉及一种葛根外泌体及基于其的骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂和在制备预防/治疗骨疾病制剂中的应用。
背景技术：2.骨质疏松症(osteoporosis，op)是一种以骨密度和质量下降、骨组织微结构破坏并伴有骨痛为特征的全身代谢性骨病。随着人口老龄化进程的加剧，op所致的社会经济负担和医疗负担愈发严重。髋部和脊椎是op患者常见的两个骨折部位，骨折发生后严重影响患者生活质量。目前临床上主要以生活方式调整、骨健康补充剂添加、药物干预和康复治疗为主，尚无其它有效干预和预防手段。
3.随着中医药在防病治病中的独特优势不断显现，许多中药药方或制剂在防治骨质疏松的研究被大量报道。但由于中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，许多中药的有效成分及作用机制仍未得到有效阐释。中医关于op的病因病机，目前主要是与肾、肝、脾等有关系。其中肾气盛衰是骨质枯荣的根本，脾胃虚损致气血不足，肝失疏泄致瘀阻脉络是导致骨质疏松症重要因素。所以op的基本病理机制是以肾精亏虚，骨髓化源不足，不能营养骨骼为主，肾虚骨骼失养为本，脾胃虚弱，肝郁血瘀，劳逸失度，感受外邪为标，为本虚标实之证。因此，目前研究的单味药以补肾阳药物为主，多温燥，若长期服用并不适宜；健脾益气、疏肝理气及活血祛瘀中药对op的作用研究较少。
4.葛根(pueraria lobata)是野葛或干葛藤的根，具有解热抗炎、调理脾胃、降低血管阻力增加冠状血流量等多种功效。已有研究发现，从葛根中提取得到的黄酮苷葛根素(puerarin)能促进成骨细胞分化，但效果并不显著。
技术实现要素：5.为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种葛根外泌体。
6.本发明另一目的在于提供一种基于上述葛根外泌体的骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂。
7.本发明的葛根外泌体成分天然，无毒副作用，且具有优异的促进hbmscs成骨分化的效果，并可显著诱导成骨分化的标志蛋白、标志基因上调表达，可获得2倍及以上的标志蛋白表达水平、最高12倍及以上的opn基因表达水平，可用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂。
8.本发明的再一目的在于提供上述葛根外泌体在制备预防/治疗骨疾病制剂中的应用，特别是制备预防/治疗骨质疏松制剂中的应用。
9.本发明的葛根外泌体可显著促进hbmscs成骨分化，可用于制备预防/治疗骨疾病制剂，特别是制备预防/治疗骨质疏松制剂。
10.本发明的目的通过下述方案实现：
11.一种葛根外泌体，从葛根中提取得到，包括以下步骤：
12.将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-70min，离心所得第一沉淀用无菌pbs溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-100min，所得二次沉淀即为葛根外泌体。
13.进一步的，包括以下步骤：
14.将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-60min，离心所得第一沉淀用无菌pbs溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-90min，所得二次沉淀即为葛根外泌体。
15.进一步的，所述分离可通过采用医用纱布等过滤分离得到溶液。分离固体及溶液，可除去大颗粒的葛根等杂质，以便于后续的操作。
16.更进一步的，所述分离后还可以进行过筛处理，如依次过70μm筛子、40μm筛子。所用筛子的尺寸可根据需要调整使用，逐层过筛可进一步除去大颗粒的杂质，以免在后续过滤器过滤的阶段造成堵塞，影响过滤效果及收率。
17.更进一步的，所述过筛后还可进行离心处理，优选在2500-4000rpm转速下离心10-20min，获得所述溶液。通过在低转速下进行离心处理，可将一部分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续分离的影响。
18.进一步的，所述第一过滤前还可进行初过滤及离心处理，如先采用5μm过滤器进行过滤，滤液在10000g的转速下离心30-60min；离心所得上清液再采用0.8μm过滤器进行过滤，滤液在10000g的转速下离心30-60min，所得上清液再用于进行第一过滤。
19.上述初过滤及离心处理，可通过逐次过滤及离心操作进一步除去大颗粒的非目标物质，以免影响后续0.45μm和0.22μm过滤器的过滤效果，有利于后续过滤的顺利开展。
20.进一步的，所述的孵育优选在30-60℃下进行，更优选在37-40℃。
21.进一步的，所述孵育的时间优选为12-24h。
22.进一步的，所用葛根和水按质量体积比可为1:1-1:2，g/ml。
23.进一步的，所用的水优选为双蒸水。
24.进一步的，所述葛根浸泡前优选先处理为小块以便于使用；更优选为先洗净及切块。
25.进一步的，所得二次沉淀可用水、pbs缓冲液或者细胞培养基等溶解获得溶液。
26.本发明的葛根外泌体由葛根水提取分离得到，成分天然，无毒副作用，对人骨髓间充质干细胞(hbmscs)的生物毒性低。
27.进一步的，本发明的葛根外泌体还可用于制备预防/治疗骨疾病制剂中，特别是用于制备预防/治疗骨质疏松制剂中。
28.进一步的，本发明的葛根外泌体的使用浓度可为大于等于5μg/ml。
29.更进一步的，本发明的葛根外泌体的使用浓度可为5μg/ml-30μg/ml。
30.本发明还提供一种基于上述葛根外泌体的骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂。在人骨髓间充质干细胞(hbmscs)成骨分化测试中可见，本发明葛根外泌体具有优异的促进hbmscs成骨分化的效果，并可显著诱导成骨分化的标志蛋白、标志基因上调表达，可获得2
倍及以上的标志蛋白表达水平、最高12倍及以上的opn基因表达水平，可作为骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
32.图1为本发明葛根外泌体的红外光谱图。
33.图2为本发明葛根外泌体的液相色谱图。其中，a为空白溶剂甲醇，b为葛根素标准品，c为本发明葛根外泌体。
34.图3为本发明葛根外泌体不同浓度对hbmscs细胞活性影响的结果图。
35.图4为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的茜素红染色光镜图。
36.图5为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的标志基因表达图。
37.图6为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的标志蛋白统计图。
38.图7为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的标志蛋白凝胶电泳图。
具体实施方式
39.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
40.一实施方式，一种葛根外泌体，将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-70min，离心所得第一沉淀用无菌pbs溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-100min，所得二次沉淀即为葛根外泌体。
41.在一些优选实施例中，包括以下步骤：将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-60min，离心所得第一沉淀用无菌pbs溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-90min，所得二次沉淀即为葛根外泌体。
42.在一些优选实施例中，所述分离可通过采用医用纱布等过滤分离得到溶液。分离固体及溶液，可除去大颗粒的葛根等杂质，以便于后续的操作。
43.在一些优选实施例中，所述分离后还可以进行过筛处理，如依次过70μm筛子、40μm筛子。所用筛子的尺寸可根据需要调整使用，逐层过筛可进一步除去大颗粒的杂质，以免在后续过滤器过滤的阶段造成堵塞，影响过滤效果及收率。一实施例中，所述分离后依次过70μm筛子、40μm筛子。另一实施例中，所述分离后依次过100μm筛子、40μm筛子。
44.在一些优选实施例中，所述过筛后还可进行离心处理，优选在2500-4000rpm转速下离心10-20min，获得所述溶液。通过在低转速下进行离心处理，可将一部分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续分离的影响。一实施例中，所述过筛后还在2500rpm转速下离心10min。另一实施例中，所述过筛后还在4000rpm转速下离心20min。再一实施例中，过筛后还
2996高效液相色谱仪进行测定。图1为本发明葛根外泌体的红外光谱图。图2为本发明葛根外泌体的液相色谱图。由图可见，本发明葛根外泌体与葛根素标准品色谱图具有明显的区别，证明本发明葛根外泌体所含物质成分与葛根素存在较大的差异。
60.实施例2：葛根外泌体蛋白浓度的测定
61.以bca蛋白测定试剂盒对所获取的葛根外泌体进行定量，具体步骤如下：
62.(1)将蛋白标准品加无菌pbs缓冲液稀释，终浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；各浓度蛋白标准品取20μl分别加入到96孔板的标准品孔中，用于制备标准曲线；
63.(2)将实施例1制备得到的葛根外泌体溶解于无菌pbs缓冲液中，得到葛根外泌体溶液；取20μl葛根外泌体溶液加入到96孔板的样品孔中；
64.(3)各孔加入200μl的bca工作液，37℃放置20-30min；
65.(4)用酶标仪测定a562值，或540-595nm波长的吸光度；
66.(5)根据标准曲线计算样品中蛋白质浓度。
67.最终测定本发明所得的葛根外泌体溶液浓度为0.38μg/μl。
68.实施例3：葛根外泌体对人骨髓间充质干细胞(hbmscs)活性的影响
69.具体内容如下：
70.(1)将葛根外泌体加入α-mem完全培养基中，得到浓度分别为5μg/ml、10μg/ml的溶液；以α-mem完全培养基为空白对照；
71.(2)将p5代人骨髓间充质干细胞(hbmscs)(购于赛业(广州)生物科技有限公司，产品名称成人骨髓间充质干细胞，huxma-01001)接种培养于96孔板中，接种密度为5
×
103/孔；待细胞贴壁后，以步骤(1)得到的溶液及空白对照分别处理48h、72h；每孔按10:1的比例加入cck-8试剂，在37℃下孵育2h，紫外分光光度计检测450nm的吸光度，结果见图3。
72.图3为本发明葛根外泌体不同浓度对hbmscs细胞活性影响的结果图。由图3可见，经本发明葛根外泌体孵育48h后人骨髓间充质干细胞(hbmscs)的存活率为95％以上，继续孵育至72h存活率仍保持在90％以上，表明本发明的葛根外泌体对人骨髓间充质干细胞(hbmscs)的生物毒性低。
73.实施例4：葛根外泌体促进人骨髓间充质干细胞(hbmscs)成骨分化
74.具体内容如下：
75.(1)成骨培养基为含100nmol/l地塞米松、50nmol/l抗坏血酸、10nmol/lβ-甘油磷酸酯的α-men完全培养基；在成骨培养基中分别加入葛根素或本发明葛根外泌体，浓度分别为5μg/ml、10μg/ml的溶液；以成骨培养基为空白对照；
76.(2)将p5代人骨髓间充质干细胞(hbmscs)接种培养于12孔板中，接种密度为5
×
104/孔；待细胞贴壁后，以步骤(1)得到的溶液及空白对照为培养基分别进行培养，每3天更换一次培养基。在细胞成骨分化培养14天后，去除培养基，用75％乙醇固定细胞15min，然后每孔加入茜素红s染色液进行染色，在室温下孵育20min，pbs洗去非特异性结合的茜素红s染色液，染色后的图像见图4。
77.图4为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的茜素红染色光镜图。由图4可见，经本发明葛根外泌体处理的实验组细胞染色颜色相对于空白对照、葛根素实验组显著加深，并呈剂量依赖性，表明本发明葛根外泌体能显著促进人骨髓间充质干细胞成骨分化，人
骨髓间充质干细胞已成功分化为成骨细胞。
78.实施例5：葛根外泌体对人骨髓间充质干细胞hbmscs成骨基因的影响
79.通过qpcr实验检测诱导效果，具体内容如下：
80.(1)培养基如实施例4步骤(1)；
81.(2)将p5代人骨髓间充质干细胞(hbmscs)接种培养于12孔板中，接种密度为5
×
104/孔；待细胞贴壁后，以步骤(1)得到的溶液及空白对照为培养基分别进行培养，每3天更换一次培养基。在细胞成骨分化培养14天后，去除培养基，pbs清洗一次，根据trizol产品说明书提取总rna，根据逆转录试剂盒说明书将rna逆转录成cdna，最终根据sybr说明书，使用荧光定量pcr仪检测各组mrna表达量。
82.图5为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的标志基因表达图。由图可见，成骨分化的标志基因alp、osterix和opn基因表达明显上升，当本发明葛根外泌体浓度为10μg/ml时，最高可获得12倍及以上的opn基因表达水平；表明本发明葛根外泌体可显著诱导成骨分化的标志基因上调表达，能显著促进人骨髓间充质干细胞成骨分化；且与葛根素相比，本发明葛根外泌体具有更突出的诱导效果。
83.实施例6：葛根外泌体对人骨髓间充质干细胞hbmscs成骨蛋白的影响
84.通过western blot检测诱导效果，具体内容如下：
85.(1)培养基如实施例4步骤(1)；
86.(2)将p5代人骨髓间充质干细胞(hbmscs)接种于60mm细胞培养皿中，接种密度为1
×
105/孔；等细胞密度生长至80％后，以步骤(1)得到的溶液及空白对照为培养基分别进行培养，在ripa裂解缓冲液中裂解细胞30min，裂解后在12000g的转速下离心10min，上清液使用bca蛋白测定试剂盒测定细胞总蛋白浓度，将蛋白浓度进行配平后按1:4加入5
×
loading buffer，放入100℃沸水中煮5min；从每个分组抽取15μg蛋白加入10％的sds-page凝胶中60v恒定电压电泳分离2h；分离后将蛋白转移至pvdf膜中，然后将膜放在5％脱脂牛奶中封闭1h，封闭后将膜置于runx2(1:1000)、alp(1:1000)、opn(1:1000)、osterix(1:1000)和gapdh(1:1000)等特异性一抗中4℃孵育过夜；回收一抗后，用tbst洗膜30min，10min一次，洗3次。冲洗后，将膜与羊抗兔的二抗(1:5000)在室温下孵育1h，孵育后再次使用tbst冲洗1h，15min一次，洗4次。冲洗后，使用快速化学发光液均匀覆盖于膜上，放置1-2min，随后将膜取出放置于化学发光成像仪中检测。
87.图6为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的标志蛋白表达图。图7为本发明葛根外泌体诱导hbmscs成骨分化的标志蛋白凝胶电泳图。由图可见，alp、osterix、opn、runx2等成骨标志蛋白表达明显上升，可获得2倍及以上的蛋白表达水平；表明本发明葛根外泌体可显著诱导成骨分化的标志蛋白上调表达，能显著促进人骨髓间充质干细胞成骨分化，并呈剂量依赖性；且与葛根素相比，本发明葛根外泌体具有更突出的诱导效果。
88.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种葛根外泌体，其特征在于从葛根中提取得到，包括以下步骤：将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-70min，离心所得第一沉淀用无菌pbs溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-100min，所得二次沉淀为葛根外泌体。2.根据权利要求1所述的葛根外泌体，其特征在于包括以下步骤：将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-60min，离心所得第一沉淀用无菌pbs溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-90min，所得二次沉淀为葛根外泌体。3.根据权利要求1或2所述的葛根外泌体，其特征在于：所述分离后还进行过筛处理。4.根据权利要求3所述的葛根外泌体，其特征在于：所述过筛后还进行离心处理，在2500-4000rpm转速下离心10-20min。5.根据权利要求1或2所述的葛根外泌体，其特征在于：所述第一过滤前还进行初过滤及离心处理，先采用5μm过滤器进行过滤，滤液在10000g的转速下离心30-60min；离心所得上清液再采用0.8μm过滤器进行过滤，滤液在10000g的转速下离心30-60min；所得上清液再用于进行第一过滤。6.根据权利要求1或2所述的葛根外泌体，其特征在于：所述的孵育在30-60℃下进行；所述孵育的时间为12-24h。7.根据权利要求1或2所述的葛根外泌体，其特征在于：所用葛根和水按质量体积比为1:1-1:2，g/ml。8.一种骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂，其特征在于所述骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂为权利要求1-7任一项所述的葛根外泌体。9.权利要求1-7任一项所述的葛根外泌体在制备预防/治疗骨疾病制剂中的应用。10.权利要求1-7任一项所述的葛根外泌体在制备预防/治疗骨质疏松制剂中的应用。
技术总结本发明属于生物医学材料技术领域，特别涉及一种葛根外泌体及基于其的骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂和在制备预防/治疗骨疾病制剂中的应用。本发明葛根外泌体，从葛根中提取得到，包括以下步骤：将葛根浸泡在水中孵育，分离，所得溶液采用0.45μm过滤器进行第一过滤，第一滤液在100000g的转速下离心30-70min，离心所得第一沉淀用无菌PBS溶解后，再用0.22μm过滤器进行第二过滤，第二滤液在100000g的转速下离心70-100min，所得二次沉淀为葛根外泌体；其具有优异的促进hBMSCs成骨分化的效果，可作为骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂，还可用于制备防治骨疾病制剂，特别是防治骨质疏松制剂。制剂。制剂。
技术研发人员：李鹏 林颢 楚佳奇 詹伟强 洪冠豪
受保护的技术使用者：广东医科大学附属医院
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
