一种耐盐长枝木霉hl167对豇豆解盐促生及其防治枯萎病的应用
技术领域
1.本发明涉及植物保护技术领域，特别涉及一种耐盐长枝木霉hl167对豇豆解盐促生及其防治枯萎病的应用。
背景技术：2.木霉菌(trichoderma spp)是一种在土壤中广泛分布的丝状真菌，具有较强的抗菌能力，在促进植物生长发育和提高植物抗病性的同时，也具有调控土壤微生物环境和缓解土壤中盐分胁迫等特性。因此木霉菌被广泛用于土壤改良、生态环境的修复和病害防治。豇豆是人们餐桌上的美食之一，不但能调颜养身，还具有健胃补肾的作用。但是随着化学肥料的过量使用和连作，土壤的盐渍化和土传病害枯萎病越来越严重，对豇豆的生产带来一定的威胁。
3.中国专利cn109182146b筛选一株脐孢木霉菌，可抑制豇豆枯萎病菌(fusarium oxysporum schl.)；中国专利cn108342330b筛选一株对枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌具有抑制作用的长枝木霉，并促进黄瓜的发芽率和发芽长度。现有技术缺少长枝木霉对豇豆幼苗进行灌根预处理，可有效预防豇豆枯萎病，并提高豇豆枯萎病的防治效果。
技术实现要素：4.鉴于此，本发明筛选出一株耐盐长枝木霉hl167，应用于豇豆的解盐促生作用，并可有效防治豇豆的枯萎病。
5.本发明提供的耐盐长枝木霉hl167(trichoderma longibrachiatum hl167)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国广州，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，菌种保藏编号为gdmcc no：62075，保藏日期为2021年11月22日。经形态学与tef和rbp2序列分析，将其鉴定为长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)，序列表如下：
6.》hl167 tef序列
7.caacctggatgcttgatatcccgggcgtgtcgcccttcatcgagaagttcgagaaggtaagcttgagatcccttcaattttcggacgatttcctgtgcctctgcccaacatcttttttttcaccacctcgctttctcctacccctcctttgggcgacgcaaattttttttgttgcgtttcgggttttagtggggatgcacctccagcaaaccactatcctctgccgccctctgctctcgtctccaacacctttggcgcttgcgtcatcaaccttccaacagtctgcgcagcaatgctaatcattttcccctcaacaggaagccgccgaactcggcaagggttccttcaagtacgcgtgggttcttgacaagctcaaggccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgacattgccctctggaagttcgagactcccaagtactatgtcaccgtcattggtatgtttgatcccgtgcactcattgcatcatcgccacaacaacatactaatgccctctgacagacgctcccggccaccgtgatttcatcaagaacatgatcactggtacttcccaggccgactgcgccattctcattattgccgccggtactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctgctcgcctacaccctgggtgtcaagcagctcatcgtcgccatcaacaagatggacactgccaactgggccgaggctcgttaccaggaaatcatcaaggagacttccaacttcatcaagaaggtcggcttcaaccccaaggccgttgctttcgtccccatctccggcttcaacggtga
caacatgctcaccccctccaccaactgcccctggtacaagggctgggagaaggagaccaaggctggcaagttcaccggcaagaccctccttgaggccatcgactccatcgagccccccaagcgtcccacggacaagcccctgcgtctgcccctgcaggacgtctacaagatcggtggtatcggaacagttcccgtcggccgtatcgagactggtgtcctcaagcccggcatggtcgtcaccttcgccccctccaacgtcaccactgaagtcaagtccgttgagatgcaccacgagcagctcgccgagggccagcccggtgacaacgttggtttcaacgtgaagaacgtttccgtcaaggaaatccgccgtggcaacgttgccggtgactccaagaacgacccccccatgggcgccgcttctttcaccgcccaggtcatcgtcatgaaccaccccggccaggtcggtgccggctacgcccccgtcctcgactgccacactgcccacattgcctgcaagttaagggcgacacgcccggatatcgcgtcgccta
8.》hl167 rbp2序列
9.tggctggatgcttgatatcccgggcgtgtcgcccttgatgatcgtgatcacttcggaaagaagcgtctggatctggcgggtcccctgctggccaagctgttccgaggtattatgcgaagaatgaacaccgagctggccaactatttgagacgttgcgtggagggcaataggcatttcaacctcgcggtcggcatcaagcctggcacgctctccaacggcttgaagtattcgctcgccactggaaactggggtgatcagaagaaggccatgagctcgactgcaggagtgtctcaggtgctcaaccgatacacgttcgcctcgaccctctcgcatttgcgccgcaccaacacgcccatcggaagagacggcaagctggcgaagcctcgacagctgcacaacacccattggggtctggtctgcccggccgagacgcccgaaggacaggcctgtggtcttgtcaagaacctgtctctgatgtgttatgtcagtgtcggctctccctcagagccgttgatcgagtttatgatcaataggggcatggaagtggtcgaggaatacgagccgctgcgttatcctcacgctaccaagatctttgtcaacggtgtctgggtgggcattcaccaagatcccaaacatctggtgcagcaggtcgtggacactcgtcgtaagtcgtacctgcagtacgaggtctctctggtcagagaaattcgagaccaggagttcaagatcttctccgacgcaggccgcgtcatgcgacccgtctttaccgtccagcaagatgacgagtcggacactggcattcccaagggccacttggtcctgaccaaagacctcgttaataaattggcccaggagcaggccgagcctccagaagacccaagcatgaagattggttgggagggactcatcagggctggtgcagttgaatatctcgacgccgaggaagaggagacggccatgatttgcatgactcccgaggatctcgagctgtatcgtgcgcaaaaggcaggtattgccaccgaagaggacgttggcgacgatccgaacaagcgactcaagacgaggacaaacccaacaacgcacatgtacacgcactgcgagatccatccaagcatgatcttgggtatttgcgcgagcatcattcctttccccgatcacaaccaggtatgttcacccacattctttgcccatccttggctcctcctgcacaggcgctaactgcgtgcagtccccccgtaacacctaccaatctgccatgggctaaacta
10.该长枝木霉hl167对豆科植物具有解盐促生的作用，具体为可有效促进豇豆的生长，可提高豇豆叶绿素含量、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性和可溶性蛋白的含量，并降低豇豆的丙二醛含量，从而有效解除盐分对豇豆的胁迫作用，并修复盐胁迫环境对豇豆造成的损伤，促进盐胁迫下豇豆的生长。
11.该长枝木霉hl167还可抑制豇豆枯萎病的植物病原真菌，具体为对尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用，对豇豆枯萎病防治效果优于传统农药多菌灵，而且预防效果比治疗作用更好。
附图说明
12.图1为本发明的木霉菌对尖孢镰刀菌的抑制率和对峙培养形态
13.图2为本发明的木霉hl167的菌落形态、分生孢子、菌丝和后垣孢子形态
14.图3为本发明的长枝木霉hl167对豇豆幼苗株高和根长影响
15.图4为本发明采用不同处理方式对豇豆幼苗的叶绿素、丙二醛含量、可溶性蛋白含
量以及过氧化物酶和过氧化氢酶活性的影响
16.图5为本发明的田间试验下不同处理方式对豇豆枯萎病的防效测定结果
具体实施方式
17.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
18.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
19.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
20.实施例1-菌株分离纯化
21.分别从中国的宁夏省、青海省、黑龙江省和甘肃省的盐碱地区采集土壤。采集地的土壤为中度盐碱，土壤样品距离地表15cm至25cm。将纯化后的木霉菌转接到pda(ph 7.2)平板上，28℃培养，待木霉菌丝长满平板时，利用打孔器打取菌饼，分别转接到含2％、4％、6％和8％nacl的pda平板上继续培养，并在3d和7d后，测量菌落直径，观察其孢子颜色及产孢情况，结果如表1：
[0022][0023][0024]
由表1可知，在含2％、4％、6％和8％的nacl的培养基中分别培养3d和7d后，木霉hl167都能生长和产生孢子，在含6％nacl培养基中培养3d和7d后，hl167木霉在培养7d后，其生长没有受到明显抑制，且可以产生分生孢子，菌落为黄绿色，在含8％的nacl培养基中在培养7d后，hl167菌株的产孢覆盖菌落3/5且孢子颜色为黄绿色，以上结果表明木霉菌hl167具有较强的耐盐性。
[0025]
实施例2-菌株对尖孢镰刀菌的平板对峙实验
[0026]
采用5mm无菌打孔器分别打取木霉菌和尖孢镰刀菌(f.oxysporum)的菌饼，将不同木霉菌株和f.oxysporum菌饼分别转接到同一pda平板中，接种点相距约4cm。以单独接种f.oxysporum为对照组，每个处理三次重复。28℃恒温培养4d后，测量对峙培养中病原菌与木霉菌的菌落半径，计算其抑制率：抑制率(％)＝(尖孢镰刀菌菌落半径﹣木霉菌落半径)/(尖孢镰刀菌菌落半径﹣0.5)
×
100，对峙结果如图1所示。
[0027]
由图1可知，平板对峙试验结果表明有19株木霉菌对f.oxysporum具有一定的拮抗效果，其中4株木霉菌(nx044,nx022,qh100,hl167)对f.oxysporum的拮抗作用较强，其抑制率均在72％以上(图1a)，其中木霉菌hl167对f.oxysporum抑制率为73.08％；在平板对峙过程中，发现木霉菌hl167与f.oxysporum接触后，木霉菌菌丝可以快速覆盖病原菌(图1b)。
[0028]
实施例3-菌落形态观察
[0029]
将木霉hl167分别转接到pda、sna和cmd培养基中，28℃培养4d后，观察其菌落生长情况，长枝木霉hl167在pda、sna和cmd培养基上的菌落，以及在pda培养基上的分生孢子、厚垣孢子、菌丝和分生孢子梗的形态的光学显微镜和电子显微镜观察结果如图2所示。
[0030]
由图2可知，在pda培养基上，菌落从中心向外，呈现出一圈不规整的半圆环状，分生孢子呈现浅绿色，圆环外有大量的辐射状的白色菌丝；在cmd培养基上，分生孢子为浅绿色，菌落呈现从中心向外扩散的两圈圆环，每圈圆环表面都被有白色的菌丝覆盖；在sna培养基上，分生孢子呈现浅绿色，菌落在培养基表面，无规则的零散分布，含白色菌丝的菌落更多地分布在远离接种中心的一侧(图2a，b，c)；木霉hl167在pda上生长速度较快，3d可以长满整个平板，气生菌丝从接种中心开始产生，初始为白色绒毛状，随后分生孢子由白色变为黄绿色(图2d，e)，分生孢子呈现椭球型(图2f)，菌丝具有较长的分支，次级分支比较短，分支简单，不规则。瓶颈圆柱形或弯曲，常单生，距离顶端较远出由再分支，在瓶梗顶端，形成粘的分生孢子球，外观为球形或者椭球形(图2g，h)。厚垣孢子为灰绿色，外观呈现球形或椭球形，且定位于菌丝顶端，厚垣孢子丰富(图2i)；在电子显微镜下，分生孢子呈椭球形，3.2
×
4.2μm，外观整体较饱满，菌丝密集且呈现多个无规则的小分支，菌丝表面较光滑(图2j，k，l)。
[0031]
实施例4-长枝木霉hl167对豇豆的解盐促生试验
[0032]
长枝木霉hl167对豇豆的解盐促生试验分为四组，清水处理为ck组、长枝木霉hl167处理为t组、200mm nacl盐水处理为salt组、采用长枝木霉hl167灌根预处理2d后，随后用200mm nacl盐水处理为t+salt组。
[0033]
试验选取2-3片真叶期的豇豆幼苗为供试植株，每个处理用100ml长枝木霉hl167分生孢子液(浓度为107孢子/ml)或无菌水或盐水进行灌根处理，每组处理20株豇豆，试验三次重复，灌根处理14d后，测定株高和根长，测定结果如图3，注：a为豇豆幼苗的形态，b为豇豆幼苗株高和根长，不同的小写字母“a,b,c,d
……”
，表示使用spss 17.0软件进行duncan多范围测试后，在p《0.05时存在显著差异；同时测定叶绿素含量、丙二醛含量和可溶性蛋白含量，过氧化物酶和过氧化氢酶活性测定，测定结果如图4，注：a为叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，b为丙二醇含量，c为可溶性蛋白含量，d为过氧化物酶活性，e为过氧化氢酶活力，不同的小写字母“a,b,c,d
……”
，表示使用spss17.0软件进行duncan多范围测试后，在p《0.05时存在显著差异。
[0034]
实验方法：
[0035]
1、测定叶绿素含量：(1)取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。(2)称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml、95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3～5min。(3)取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。(4)用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用乙醇定容至25ml，摇匀。(5)把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。
[0036]
2、测定可溶性蛋白含量：(1)标准曲线的绘制。取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
[0037]
(2)样品测定。
①
样品提取。称取鲜样0.25-0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。
②
吸取样品提取液1.0ml(视蛋白质含量适当稀
释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质的含量。
[0038][0039]
3、丙二醛含量(索莱宝bc0020)，过氧化物酶pod(索莱宝bc0090)和过氧化氢酶cat(索莱宝bc0200)活性测定均采用索莱宝试剂盒。
[0040]
结果如表2：
[0041][0042][0043]
由表2的可知，与清水对照相比，单独使用200mm nacl盐水处理的豇豆幼苗(salt)，幼苗的株高和根长分别降低了33.99％和29.17％，单独使用长枝木霉hl167处理豇豆幼苗(t)，幼苗的株高和根长分别提高了13.21％和17.61％，使用长枝木霉hl167预处理豇豆幼苗2d后，再用盐水灌根处理豇豆苗(t+salt)，其株高和根长分别降低7.51％和13.81％；而t+salt组与salt组相比，显示t+salt组促进了植物株高和根长，增长率分别为40.10％和21.69％，表明长枝木霉hl167可有效缓解盐胁迫对豇豆生长产生的不良影响。
[0044]
由表2的叶绿素含量可知，与ck组相比，t组豇豆幼苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量分别提高了43.85％，55.00％和46.56％，salt组则分别降低了1.60％，20.00％和6.07％，t+salt组叶绿素b降低了5.00％，而叶绿素a和叶绿素总量提高了12.83％和8.10％；t+salt组与salt组相比，t+salt处理提高了植物总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量，提高率分别为15.09％、14.67％和18.75％，实验表明长枝木霉hl167可提高豇豆的叶绿素含量，可有效缓解盐胁迫对植物光合作用产生的不利影响。
[0045]
由表2的丙二醛含量可知，与ck组相比，t组豇豆幼苗叶片的丙二醛含量降低了11.94％，salt组提高了9.84％，而t+salt组则下降了1.33％；t+salt组与salt组相比，t+salt组处理使植物丙二醛含量下降10.17％，实验表明长枝木霉hl167可以缓解盐胁迫对植物造成的损伤。
[0046]
由表2的可溶性蛋白含量可知，与ck组相比，t组、salt组和t+salt组的豇豆幼苗新鲜叶片中可溶性蛋白含量，分别提高了71.91％、55.90％和85.96％；t+salt组与salt组相比，t+salt组处理提高了植物可溶性蛋白的含量(提高19.28％)，实验表明，长枝木霉hl167可以通过提高植物可溶性蛋白的含量，从而缓解盐胁迫对植物的损伤。
[0047]
由表2的过氧化物酶活性可知，与ck组相比，t组、salt组和t+salt组的豇豆幼苗新鲜叶片的过氧化物酶活性，分别提高了109.32％、2.3倍和3.27倍；t+salt组与salt组相比，t+salt组处理使植物体内的过氧化物酶活性提高了88.91％，表明长枝木霉hl167预处理豇豆幼苗后，可以通过提高植物体内过氧化物酶活性，减轻盐胁迫对植物氧化损伤。
[0048]
由表2的过氧化氢酶活性可知，与ck组相比，t组、salt组和t+salt组的豇豆幼苗新鲜叶片的过氧化氢酶活性，分别提高了71.25％、1.2倍和1.34倍；t+salt组与salt组相比，t+salt组则提高了26.94％，表明长枝木霉hl167预处理豇豆幼苗后，可以通过提高过氧化氢酶活性，分解盐胁迫下产生的过氧化氢，来减轻盐胁迫对植物的氧化损伤。
[0049]
实施例5-长枝木霉hl167对豇豆枯萎病的田间防效评价
[0050]
实验方法：(1)尖孢镰刀菌孢子悬浮液的制备
[0051]
用5mm无菌打孔器打取f.oxysporum菌饼，将菌饼接种到装有100ml pd液体培养基的250ml三角瓶中，28℃，120r/min震荡培养7d。用4层的无菌纱布过滤菌丝，收集滤液后在5000rpm/min条件下，离心10min。收集孢子，并加入适量的无菌水稀释，用血球计数板调节至孢子浓度至1
×
106孢子/ml以备用。
[0052]
(2)田间试验分为以下五个组：1.使用木霉hl167孢子悬浮液对豇豆幼苗进行灌根处理，2d后接种尖孢镰刀菌(t+fo组)；2.尖孢镰刀菌接种豇豆幼苗2d后，用木霉hl167进行灌根处理(fo+t组)；3.尖孢镰刀菌接种豇豆幼苗2d后，使用多菌灵处理植株(fo+ca组)；4.清水处理植株，2d后接种尖孢镰刀菌(fo组)；5.清水对照组(ck组)。每一个小区面积20m2，每个处理3个随机小区，试验重复3次，培养14d后测定豇豆枯萎病的防治效果。
[0053]
(3)木霉菌对豇豆枯萎病的防效调查
[0054]
豇豆枯萎病的病情指数调查根据以下标准进行：0级：微管内茎束正常，无外在症状，微管内茎束变色程度低于1/4；1级：微管内茎束变色程度从1/4变到1/2；2级：微管内茎束变色程度从1/2到3/4；3级：微管内茎束变色程度超过3/4，有些叶子枯萎；4级：整个植物枯萎。病情指数和防病效果按以下公式计算：
[0055]
病情指数＝[σ(每个病情级别的豇豆植株数
×
病情级别数)/豇豆盆栽植株总数
×
病情最高级别数]
×
100
[0056]
防病效果(％)＝[对照组的病情指数－处理组的病情指数]/对照组的病情指数
×
100
[0057]
实验结果如图5，注：不同的小写字母“a,b,c......”表示使用spss 17.0软件进行duncan多范围测试后，在p《0.05时存在显著差异，结果如表3:
[0058]
项目t+fo组fo+t组fo+ca组fo组病情指数15232739防病效果(％)61.5441.0330.77—
[0059]
由表3可知，田间防效试验表明，只接种f.oxysporum的对照组(fo组)病情指数为39，采用长枝木霉hl167灌根处理幼苗2d后，接种f.oxysporum(t+fo组)，病情指数为15，其防病效果为61.54％；先接种f.oxysporum 2d后，用木霉对豇豆幼苗灌根处理(fo+t组)，病情指数为23，对应的防病效果为41.03％。先接种f.oxysporum 2d后，再使用多菌灵菌剂处理豇豆(fo+ca组)，病情指数为27，防病效果为30.77％，由实验表明采用长枝木霉hl167对豇豆进行灌根处理，可使豇豆枯萎病的防治效果达到61.54％和41.03％，其防治效果优于传统农药多菌灵，且预防效果比治疗作用更好。
[0060]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种耐盐长枝木霉hl167，其特征在于，长枝木霉hl167(trichoderma longibrachiatumhl167)，于2021年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：中国广州，菌种保藏号为gdmcc no：62075。2.根据权利要求1的一种耐盐长枝木霉hl167的应用，其特征在于，长枝木霉hl167对豆科植物解盐促生的应用。3.根据权利要求2的一种耐盐长枝木霉hl167的应用，其特征在于，长枝木霉hl167对豆科植物解盐促生的方法为，将耐盐长枝木霉hl167发酵培养制备成孢子含量包括107/ml的分生孢子液，将分生孢子液对豆科植物幼苗采用灌根处理至少2d。4.根据权利要求2的一种耐盐长枝木霉hl167的应用，其特征在于，长枝木霉hl167在抑制豆科植物枯萎病的植物病原真菌的应用。5.根据权利要求4的一种耐盐长枝木霉hl167的应用，其特征在于，长枝木霉hl167对尖孢镰刀菌具有抑制作用。6.根据权利要求1～5的一种耐盐长枝木霉hl167对豆科植物解盐促生和防治豆科植物枯萎病的应用，其特征在于，所述豆科植物为豇豆。
技术总结本发明提出了一种耐盐长枝木霉HL167对豇豆解盐促生及其防治枯萎病的应用。本发明从盐碱地土壤筛选分离纯化，获得了耐盐、对尖孢镰刀菌具拮抗作用的长枝木霉HL167。采用长枝木霉HL167制备的分生孢子液进行灌根处理，可有效缓解盐胁迫对豇豆造成的损伤并促进豇豆幼苗的生长，具体表现为可提高豇豆幼苗的株高、根长、叶绿素含量和可溶性蛋白含量，增强过氧化物酶、过氧化氢酶的酶活性，降低丙二醛的含量，还可有效提高对豇豆枯萎病的防治效果，且可使豇豆幼苗对枯萎病具有好的预防作用。可使豇豆幼苗对枯萎病具有好的预防作用。可使豇豆幼苗对枯萎病具有好的预防作用。
技术研发人员：刘铜 刘震
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2021.12.30
技术公布日：2022/7/5
