一种具有抗氧化作用的活性六肽及其应用

1.本发明属于化妆品功能性原料技术领域，具体涉及一种具有抗氧化作用的活性六肽及其应用。


背景技术：

2.化妆品是由各种原料经过合理调配加工而成的复配混合物，化妆品的原料种类繁多,性能各异。其中，化学合成和植物提取一直是化妆品功能性原料的主要来源。而随着传统化妆品原料的不断更新发展，生物美容与基因美容成为发展的新向标，特别是胜肽类原料和含有胜肽的护肤品越来越受到人们的青睐。胜肽活性成分是由一定序列组成的多个氨基酸，由于生物体内的多数生化反应和进化过程在一定程度上都是由特定的氨基酸序列(多肽或蛋白质)来调控的，因此生物活性胜肽为化妆品原料提供了全新的方向和思路。
3.人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮层中最主要的细胞，对于维持皮肤的弹性和张力具有重要的作用。人皮肤成纤维细胞具有很强的蛋白质合成能力，可以合成并分泌大量弹性蛋白、胶原蛋白、糖胺多糖和糖蛋白等基质成分，进而生成弹性纤维、胶原纤维和网状纤维，并分泌多种细胞修复因子，使得皮肤具有强大的更新与自我修复能力。因此，人皮肤成纤维细胞的细胞活力和增殖性能不仅与皮肤衰老息息相关，更是对皮肤屏障起着关键作用。
4.自由基与衰老有明显的关系，科学家认为自由基是引起衰老的一个主要原因。自由基能促使体内脂褐素的生成，脂褐素在皮肤细胞中堆积即形成老年斑，在脑细胞中堆积则会引起记忆力减退或智力障碍，甚至出现老年痴呆症。自由基还可导致老年人皮肤松弛、皱纹增多、骨质再生能力减弱等。一旦机体因内因或外因导致自由基增加过量而无法及时清除时，会损伤细胞和组织，最终导致机体功能的缺失以及老化相关疾病的发生。因此，清除体内外过量的自由基在预防衰老及某些疾病的过程中具有重要作用。
5.综上所述可见，挖掘具有抗氧化活性，且能促进人皮肤成纤维细胞增殖和迁移的生物活性胜肽，并以其作为化妆品原料制备护肤品具有重要的应用前景。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种六肽，该多肽具有抗氧化活性，且能促进人皮肤成纤维细胞增殖和迁移，促进ⅰ型胶原蛋白合成，可用于抗氧化、抗衰老、促进伤口愈合等方面。
7.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
8.本发明提供了一种六肽，所述六肽的氨基酸序列如seq id no：1(ghkghk)所示。所述六肽的氨基酸序列为gly-his-lys-gly-his-lys。
9.本发明的氨基酸序列采用标准fmoc方案，通过筛选合适的树脂进行合理的合成。具体为：将目标多肽的c-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产
物。该多肽合成是一个重复添加氨基酸的固相合成过程，固相合成顺序从c端向n端合成。所述高分子树脂为交联聚苯乙烯类、聚酰胺类、聚乙烯-乙二醇类树脂类等树脂中的一种。
10.本发明还提供了上述的六肽在制备抗氧化和/或抗衰老产品中的应用。
11.本发明还提供了上述的六肽在制备促伤口愈合产品中的应用。
12.优选地，所述抗衰老为清除引起衰老的自由基。
13.优选地，所述抗衰老为提升人皮肤成纤维细胞的活力。
14.优选地，所述促伤口愈合为促进人皮肤成纤维细胞的迁移。
15.本发明以人皮肤成纤维细胞评价多肽的抗衰老、提升皮肤屏障和皮肤修复、伤口愈合等；dpph自由基清除实验评价多肽的抗氧化；鸡胚绒毛尿囊膜实验评价多肽的安全性。经研究发现，该六肽(ghkghk)在较低浓度时即可对人皮肤成纤维细胞发挥生长促进作用，促进ⅰ型胶原蛋白合成，提升皮肤弹性和紧致性，且可以有效促进细胞的迁移，体外化学抗氧化检测也表明该六肽具有抗氧化活性以及很强的清除dpph自由基的能力，可应用于抗氧化、抗衰老、促进伤口愈合等方面。
16.优选地，所述产品为药品、化妆品或保健品。
17.优选地，所述产品中含有有效剂量的六肽，余量为辅料或其它可配伍的组分。
18.进一步地，为提高产品的适用范围，所述辅料包括常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
19.进一步地，所述其它可配伍的组分包括天然药物、化学药物或生物药物。
20.优选地，为提高药品的适用范围，上述用于治疗老化相关疾病的药物，还包括药学上可接受的载体和/或辅料，如酸味剂、调色剂、香味剂、甜味剂，或其组合。
21.优选地，所述产品可制成不同的剂型，比如片剂、胶囊剂、注射剂、脂质体纳米粒、控释剂、凝胶膏剂、软膏剂、外用搽剂、贴剂、霜剂、洗涤剂、乳液、凝胶或爽肤水等。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明公开了一种六肽(ghkghk)，该多肽能促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，促进ⅰ型胶原蛋白合成，提升皮肤弹性和紧致性，具有抗氧化活性以及很强的清除dpph自由基的能力，且该六肽刺激性低、安全性高，可应用于生物制药与化妆品等领域，比如制备抗衰老化妆品、与老化相关疾病的药物、促伤口愈合产品、抗氧化产品等，具有重要的应用前景。
附图说明
24.图1为多肽的高效液相鉴定图谱；
25.图2为多肽的质谱分析图；
26.图3为六肽影响人皮肤成纤维细胞增殖的测定结果；
27.图4为六肽影响人皮肤成纤维细胞迁移率的测定结果(a为24h细胞迁移率增长曲线；b为24h细胞迁移率)；
28.图5为六肽对dpph自由基清除率的测定结果；
29.图6为六肽影响人ⅰ型胶原蛋白含量的测定结果；
30.图7为六肽的鸡胚绒毛尿囊膜测试图。
具体实施方式
31.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
33.实施例1六肽固相合成
34.本发明的氨基酸序列采用标准fmoc方案，通过筛选合适的树脂进行合理的合成。具体为：
35.选用高分子树脂【交联聚苯乙烯类中的wang树脂(王树脂)】，按照氨基酸序列(ghkghk)gly-his-lys-gly-his-lys的特征，依次从右到左添加氨基酸，先将lys的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后使lys的氨基和his的羧基进行缩水反应，反应后再添加gly，使his的氨基和gly的羧基反应，连接完最后一个gly氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽，采用高效液相色谱(hplc)纯化得到最后的多肽产品，并对多肽进行质谱(ms)分析。
36.如图1、图2所示，本实施例合成的六肽理论分子量为662.75，实际分子量为662.71，序列为：gly-his-lys-gly-his-lys。其中，gly表示英文名称为glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸及相应残基；his表示英文名称为histidine，中文名称为组氨酸的氨基酸及相应残基；lys表示英文名称为lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸及相应残基。
37.实施例2六肽对人皮肤成纤维细胞形态及增殖的影响
38.将人皮肤成纤维细胞培养在完全培养基【由基础培养基高糖dmem，10％胎牛血清(v/v)，以及1％双抗(由青霉素和链霉素组成，v/v＝1:1)组成】中，并置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养，直至在细胞培养皿中达到80％-90％的融合率后再进行传代，传至两到三代后使用全自动细胞计数仪计算细胞数。
39.将细胞按3
×
103/孔的密度接种在96孔板中(pbs作为空白对照)，当细胞贴壁后移除培养基，加入100μl含0.0032μm～2μm(0.0032μm、0.016μm、0.08μm、0.4μm、2μm)多肽的新鲜培养基，对照组则加入等量的dmem培养液，在培养箱中继续培养24h～72h后再在每孔添加10μl mtt，于培养箱继续孵育4h后再加入100μl dmso，最后置于培养箱中继续孵育4h。
40.孵育结束后在自动酶标仪上测定每孔在570nm处的光密度，即od值，每组设6个复孔。实施例实验结果见图3。
41.结果发现，当本发明中的六肽作用于人成纤维细胞72h后，各多肽组的细胞变长、细胞梭状突起增长，细胞变得更加紧密，贴壁细胞增多。同时，图3的结果显示，当多肽的浓度在0.0032μm～2μm时，对人皮肤成纤维细胞的增殖有显著性差异(
**
p＜0.01，
***
p＜0.001)，说明本发明中的六肽可以提升人皮肤成纤维细胞的活力，从而提升皮肤弹性，具有一定的抗衰老作用。
42.实施例3细胞划痕实验
43.按实施例2的方法传代培养人皮肤成纤维细胞后，在24孔板中每孔加入约5
×
104个成纤维细胞，培养24h后用200μl吸头在每孔做垂直交叉十字划痕，并用pbs清洗划落的细胞，然后每孔依次加入500μl含有0.0032μm～2μm(0.0032μm、0.016μm、0.08μm、0.4μm、2μm)多肽的无血清培养基【由基础培养基高糖dmem，1％双抗(由青霉素和链霉素组成，v/v＝1:
1)组成】继续培养，分别于0h及24h进行观察，并用imagej软件计算迁移率，迁移率＝(初始划痕宽度-相应时间点的划痕宽度)/初始划痕宽度
×
100％。
44.图4的实验结果显示，六肽在较低浓度时(0.0032μm)，便具有较明显的细胞迁移促进作用，细胞迁移率达到38.04％；而在浓度为2μm时，细胞迁移率达到83.38，较空白未加药物组提高了78.94％(空白未加药物组细胞迁移率为4.44％)。说明本发明的六肽具有提升皮肤自我修复、提升皮肤屏障及促进伤口愈合的作用。
45.实施例4六肽的dpph自由基清除活性实验
46.将180μl dpph试剂(1mg dpph用无水乙醇定容至20ml)和60μl多肽(浓度分别为0.08mm、0.4mm、2mm、10mm、50mm)添加至96孔板中作为试验组。同时设置空白组和模型组，空白组为180μl无水乙醇和60μl多肽，模型组为180μl dpph试剂和60μl超纯水，每孔设置3个复孔，室温避光反应15～30分钟。反应后用酶标仪测定517nm处的吸光度值，dpph自由基清除率＝{1-(试验组-空白组)
÷
模型组)}
×
100％。
47.图5的实验结果显示，本发明中的六肽具有一定的自由基清除作用，在浓度为50mm时，dpph清除率达到78.1％，说明本发明六肽具有一定的抗自由基和抗氧化作用。
48.实施例5六肽对人ⅰ型胶原蛋白的影响
49.按实施例2的方法传代培养人皮肤成纤维细胞后，在24孔板中每孔加入约5
×
104个成纤维细胞，培养24h后吸除培养基，并加入终浓度为0.1μm多肽的新鲜无血清dmem培养基，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中继续培养24小时。实验过程中设置阴性对照组和阳性对照组，阴性对照为等量的无血清dmem培养基，阳性对照为等量的含有血清dmem培养基。培养结束后，收集细胞培养上清液于1.5ml无菌离心管中离心后，利用人ⅰ型胶原酶联免疫试剂盒，并根据其使用说明书采用elisa法对人ⅰ型胶原蛋白(col i)含量测定进行检测。
50.图6的实验结果显示，与阴性对照相比，六肽在较低浓度时(0.1μm)，对细胞内col i的合成便具有较明显的促进作用，说明本发明的六肽具有提升胶原蛋白分泌合成的作用，对提升皮肤弹性和紧致性具有良好的效果。
51.实施例6鸡胚绒毛尿囊膜实验
52.将0日龄种蛋室温放置半天，然后气室朝上放入自动孵化箱中，将温度调至37.6
±
0.1℃，相对湿度为46
±
1％；第5日照胚，弃去白蛋和死胚；孵化到第10-12日后备用。将孵化好的种蛋去除气室端蛋壳，用生理盐水润湿蛋壳膜后轻轻剥离，暴露出绒毛尿囊膜(cam)，然后在cam上放置一个直径为1.5cm的无刺激性橡胶环；预先将1μm～50mm的多肽水分散液(50mm)置于孵蛋箱中放置半小时，然后取0.3ml直接滴加到上述橡胶环内，30分钟后观察环内cam的出血、血管溶解、凝血出血等血管效应，并按照表1的评价标准进行评比；以生理盐水为阴性对照组，1％十二烷基硫酸钠为阳性对照组。
53.表1血管效应评价标准
[0054][0055]
注：出血是指血液从cam的血管和/或毛细血管流出；凝血是指血管内和血管外蛋白的变性，通常仅见于大和中等大的血管；血管融解是指cam膜上血管消失。
[0056]
图7的测试结果显示，生理盐水阴性对照组评分为0，六肽测试组评分为0，1％十二烷基硫酸钠阳性对照组评分为3。说明本发明的六肽刺激性极低，对人体及皮肤安全性高。
[0057]
综上可见，本发明首次合成了一种六肽(ghkghk)，该多肽在较低浓度时即可对人皮肤成纤维细胞发挥生长促进作用，且可以有效促进细胞的迁移，体外化学抗氧化检测也表明该六肽具有抗氧化活性以及很强的清除dpph自由基的能力，能促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，且刺激性低、安全性高，可应用于生物制药与化妆品等领域。
[0058]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种六肽，其特征在于，所述六肽的氨基酸序列如seq id no：1所示。2.权利要求1所述的六肽在制备抗氧化和/或抗衰老产品中的应用。3.权利要求1所述的六肽在制备促伤口愈合产品中的应用。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为清除引起衰老的自由基。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为提升人皮肤成纤维细胞的活力。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促伤口愈合为促进人皮肤成纤维细胞的迁移。7.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述产品为药品、化妆品或保健品。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品中含有有效剂量的六肽，余量为辅料或其它可配伍的组分。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包括常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述其它可配伍的组分包括天然药物、化学药物或生物药物。

技术总结
本发明属于化妆品功能性原料技术领域，具体涉及一种具有抗氧化作用的活性六肽及其应用，为挖掘具有抗氧化活性，且能促进人皮肤成纤维细胞增殖和迁移的生物活性胜肽，本发明公开了一种六肽(GHKGHK)，该多肽能促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，促进Ⅰ型胶原蛋白合成，提升皮肤弹性和紧致性，具有抗氧化活性以及很强的清除DPPH自由基的能力，且该六肽刺激性低、安全性高，可应用于生物制药与化妆品等领域，比如制备抗衰老化妆品、与老化相关疾病的药物、促伤口愈合产品、抗氧化产品等，具有重要的应用前景。的应用前景。的应用前景。


技术研发人员：高理钱 贾艳 李孟础 张达 谢程亮 肖奇才 王璇 孙杰
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/5