1.本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种发酵生产腺苷的方法。
背景技术：2.腺苷(adenosine)，化学名6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，腺苷属于重要的核苷酸衍生物，是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物。作为一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。可用于治疗室上性心动过速，用于和房室有关的室上心律失常及治疗心绞痛、心肌梗塞、冠脉功能不全、动脉硬化、原发性高血压、脑血管障碍、中风后遗症、进行性肌肉萎缩等。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷在生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸(atp)或腺苷双磷酸(adp)形式转移能量，或是以环状腺苷单磷酸(camp)进行信号传递等。此外，腺苷还是一种抑制性神经传导物，在神经传递中起重要作用。
3.目前，现有技术用于生产腺苷的方法由rna水解法、化学法以及发酵法。化学合成法合成腺苷存在着成本偏高，反应繁琐，收率低等一系列问题。rna水解法同时会得到4种核苷物质，给后续的分离带来了困难。相比较而言，微生物发酵法生产腺苷成本较低，原料易得，产腺苷效率较高，因此在腺苷生产中占据绝对优势。
4.但在腺苷发酵过程中，也存在着很多问题。其一是腺苷大多采用基因工程菌种或物理、化学诱变后的菌株作为生产菌株，如枯草芽胞杆菌腺苷发酵菌株应具有以下特征：肌苷酸脱氢酶缺失，即黄嘌呤缺陷型；腺苷脱氨酶缺失，切断腺苷酸到肌苷酸的通路。腺苷磷酸化酶缺失，减少腺苷分解；解除单磷酸腺苷类终产物途径酶的反馈抑制。5
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核苷酸酶高活性，使腺苷酸迅速分解为腺苷。但发明人发现营养缺陷型菌株普遍存在遗传性状和产量不稳等问题，菌种退化现象严重，回复突变率较高，产品质量稳定性不佳，不利于工业化生产。且现有技术公开的菌葡萄糖耐受度不高，而葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。其二，腺苷用作注射剂开发，对原料的质量要求非常高，原始菌种通常存在腺苷发酵纯度低的问题，导致下游工艺复杂化，提纯成本高。其三是腺苷发酵需要提供非常丰富的营养(有机氮源)，使得腺苷发酵成本很高。其四是报道可查询的高水平的腺苷产生菌只是存在实验室水平，均没有达到大生产阶段，产业化放大对于基因工程菌是个非常大的难点，因此开发一种稳定产腺苷的发酵方法并且能够稳定产业化放大是非常必要的。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种稳定产腺苷并且能够稳定产业化放大的发酵方法。
6.一种发酵生产腺苷的方法，所述方法包括如下步骤：以产腺苷的枯草芽孢杆菌为发酵菌株，发酵过程控制发酵液葡萄糖浓度为5-60g/l，例如5-10g/l、10-20g/l、20-30g/l、
30-40g/l、40-50g/l、50-60g/l；ph为6.1-7.3，例如6.1，6.2，6.2，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3。
7.作为一种具体实施方式，所述的葡萄糖浓度为10-60g/l，优选为20-60g/l，进一步优选为30-60g/l，例如30-40g/l、40-50g/l、50-60g/l。
8.作为一种具体实施方式，所述的葡萄糖的补充方式为脉冲式补充。
9.进一步，优选的，当所述的葡萄糖浓度低于10-15g/l时，补入葡萄糖使得葡萄糖浓度为80-120g/l。
10.作为一种具体实施方式，所述的ph优选为6.3-6.4，ph通过流加氨水调节。
11.作为一种具体实施方式，所述的发酵菌株采用枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)hdcc112-21027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23448，保藏日期为2021年09月18日。
12.作为一种具体实施方式，所述枯草芽孢杆菌是通过5-20％(v/v)的接种量将种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，温度控制25-40℃，控制溶氧≥10-40％，发酵总时间48-64h。
13.作为一种具体实施方式，所述液体发酵培养基配方包含以下组分：一水葡萄糖5-240g/l,酵母膏0-50g/l,酵母粉0-50g/l，硫酸铵0-30g/l,磷酸二氢钾0-7g/l，氯化钾0-5g/l，硫酸锰0-0.05g/l，尿素0-14g/l，硫酸镁0-5g/l，氯化钠0-1g/l，所述的组分中涉及到0的不取0。
14.进一步，优选的所述液体发酵培养基包含以下组分：一水葡萄糖180g/l，酵母膏20g/l，酵母粉30g/l，硫酸铵10g/l，磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l，氨水调ph至7.0。
15.进一步，作为一种具体实施方式，所述种子液是将枯草芽孢杆菌在种子培养基里进行种子培养得到的；取培养合格的液体种子，以0.1-2.0％(v/w)的比例接种到装有液体发酵培养基，控制温度36
±
1℃，溶氧控制大于10-40％，培养5-20h，控制种子液od≥8.0；所述种子培养过程培养基为lb培养基，所述的lb培养基酵母抽提物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，葡萄糖10g/l，调ph至7.0。
16.本专利提供了一种耐高浓度葡萄糖枯草芽孢杆菌生产腺苷的方法，涉及到本株菌生产腺苷的深层液体发酵培养基配方、发酵控制方法以及补料方法等，最终得到的发酵液色纯水平接近90％，有利于提取纯化得到药典标准的腺苷成品。本方法通过使用高浓度葡萄糖为碳源，酵母膏、尿素、硫酸铵等为氮源的配方下进行深层液体发酵，50l发酵罐水平可达11.2g/l，1t发酵罐水平可达10.5g/l。
17.本发明采用耐高浓度葡萄糖的枯草芽孢杆菌生产高纯度腺苷的菌株在目前公开的腺苷生产菌株是独一的一株，较其他公开菌株的低浓度糖，发酵液色纯低不利于后续提纯，精细控制工艺对比来看，本株菌具有耐糖浓度范围广、不易染菌、控制工艺简单、最终发酵液色纯高等优点，已经可以实现了工业化生产。
具体实施方式
18.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合本技术具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部
分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
19.实施例中所述的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)hdcc112-21027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23448，保藏日期为2021年09月18日。本发明实施例中得到的发酵液参照《中国药典》2020版二部进行液相色谱分析测定。
20.实施例1
21.1、菌种复苏活化：取工作菌种甘油管(cgmcc no.23448)，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到lb固体平板，涂布均匀，置于35℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的单菌落。
22.2、液体种子制备：取活化复苏的单菌落，用接种铲挑取一颗单菌落，接种到盛有100ml lb液体培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于35℃、250rpm的摇床上振荡培养20h，控制种子液od值≥0.5。lb液体培养基消毒前调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
23.3、种子罐种子培养：取培养合格的液体种子，以0.5％(v/w)的比例接种到装有20l液体发酵培养基的50l自动控制发酵罐中，控制温度36℃，溶氧控制大于20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。罐上培养9h，控制种子液od≥8.0，种子罐配方为lb培养基，消毒前调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
24.4、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/l,氨水流加自动控制ph6.3-6.4，培养48h放罐，液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/l,酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l，消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
25.5、样品处理与检测：发酵结束后，取发酵液2ml，10000rpm高速离心10min去除菌体，然后取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，参照《中国药典》2020版二部进行液相色谱分析测定，最终效价水平达11.2g/l，纯度为90.1％。
26.实施例2
27.1、种子液制备同实施例1；
28.2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。分别过程控制发酵液葡萄糖浓度为5-10g/l、10-20g/l、20-30g/l、30-40g/l、40-50g/l、50-60g/l,氨水流加自动控制ph6.3-6.4。培养48h放罐。
29.3、液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/l,酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l。消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。最终放罐水平如下表1所示，纯度均为85～91％之间。
30.表1 不同葡萄糖浓度对应的发酵水平
31.葡萄糖浓度(g/l)发酵水平(g/l)5-105.4
10-205.320-307.230-4011.240-5010.450-609.8
32.实施例3
33.1、种子液制备同实施例1；
34.2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/l,氨水流加自动控制ph 5.5、5.8、6.1、6.4、6.7、7.0、7.3，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/l,酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l。消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平如下表2所示，纯度均为85～91％之间。
35.表2 不同ph对应的发酵水平
36.ph发酵水平(g/l)5.50.35.81.26.16.86.410.96.79.97.08.47.35.3
37.实施例4
38.1、种子液制备同实施例1；
39.2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/l,30％氢氧化钠溶液流加自动控制ph 6.4，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/l,酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l。消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平7.2g/l，纯度为85.7％。
40.实施例5
41.1、种子液制备同实施例1；
42.2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以2％、5％、10％、15％、20％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/l,氨水溶液流加自动控制ph 6.4。培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/l,酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素
7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l。消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。最终放罐水平如下表3所示，纯度均为85～91％之间。
43.表3 不同移种量对应的发酵水平
44.移种量％发酵水平(g/l)21.157.81010.91510.5209.9
45.实施例6
46.1、种子液制备同实施例1；
47.2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/l,氨水溶液流加自动控制ph 6.4，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖浓度作为梯度，酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l。消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平如下表4所示，纯度均为85～91％之间。
48.表4 不同基础葡萄糖浓度对应的发酵水平
49.基础葡萄糖浓度g/l发酵水平(g/l)607.81008.11409.918011.02208.82604.4
50.实施例7
51.1、种子液制备同实施例1。
52.2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(v/v)的比例接入装有25l的液体发酵培养基的50l自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度控制方式为：葡萄糖浓度低于10g/l,一次性添加葡萄糖使得发酵液葡萄糖浓度达80-120g/l,待葡萄糖消耗后重复此动作。氨水溶液流加自动控制ph 6.4，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/l，酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l。消毒后氨水调ph至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平为10.5g/l，纯度为92％。
技术特征：1.一种发酵生产腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以产腺苷的枯草芽孢杆菌为发酵菌株，发酵过程控制发酵液葡萄糖浓度为5-60g/l，ph为6.1-7.3。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖浓度为10-60g/l，优选为20-60g/l，进一步优选为30-60g/l。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的葡萄糖的补充方式为脉冲式补充。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的ph优选为6.3-6.4，ph通过流加氨水调节。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的发酵菌株采用枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)hdcc112-21027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23448，保藏日期为2021年09月18日。6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是通过5-20％(v/v)的接种量将种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，温度控制25-40℃，控制溶氧≥10-40％，发酵总时间48-64hr。7.如权利1～6任一所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基配方包含以下组分：一水葡萄糖5-240g/l,酵母膏0-50g/l,酵母粉0-50g/l硫酸铵0-30g/l,磷酸二氢钾0-7g/l,氯化钾0-5g/l,硫酸锰0-0.05g/l，尿素0-14g/l，硫酸镁0-5g/l，氯化钠0-1g/l。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基包含以下组分：一水葡萄糖180g/l,酵母膏20g/l,酵母粉30g/l硫酸铵10g/l,磷酸二氢钾3.5g/l,氯化钾2g/l,硫酸锰0.02g/l，尿素7g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠0.5g/l，氨水调ph至7.0。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子液是将枯草芽孢杆菌在种子培养基里进行种子培养得到的；取培养合格的液体种子，以0.1-2.0％(v/w)的比例接种到装有液体发酵培养基，控制温度36
±
2℃，溶氧控制大于10-40％，培养5-20h，控制种子液od≥8.0。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述种子培养过程培养基为lb培养基，调ph至7.0；所述的lb培养基为酵母抽提物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l,葡萄糖10g/l。
技术总结本发明公开了一种发酵生产腺苷的方法，涉及到本株菌生产腺苷的深层液体发酵培养基配方、发酵控制方法以及补料方法等，最终得到的发酵液色纯水平接近90％，有利于提取纯化得到药典标准的腺苷成品。本方法通过使用高浓度葡萄糖为碳源，酵母膏、尿素、硫酸铵等为氮源的配方下进行深层液体发酵，50L发酵罐水平可达11.2g/L，1T发酵罐水平可达10.5g/L。1T发酵罐水平可达10.5g/L。
技术研发人员：高祥 张璇 郑玲辉 澎湘屏 陈世敏 朱进伟
受保护的技术使用者：杭州中美华东制药有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/7/5
