一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用。
背景技术：2.新型冠状病毒sars-cov-2是一种能够引起人与动物肺炎的致病病毒。sars-cov-2的s蛋白分为两个亚基：s1和s2。s1亚基通过受体结合域(rbd)与细胞受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合，而s2亚基通过融合肽(fp)介导病毒与细胞膜的融合。与s1不同，s2具有高度的保守性，由于其在病毒感染靶细胞的融合过程中发挥重要作用，使其可以作为广谱保护的靶点。sars-cov-2具有较强的突变性，免疫逃逸突变体频繁涌现，其中s蛋白(包括rbd和ntd区域)上的突变不仅影响病毒的传播性和致病力，还会对针对相应靶点的单克隆抗体的中和活性产生较大的影响，极易导致免疫逃逸发生。这无疑给当下针对具有免疫优势的rbd的新冠疫苗及被动治疗策略带了挑战。
3.然而，目前尚无针对所有谱系sars-cov-2均有抑制效果的广谱中和性单克隆抗体。
技术实现要素：4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用，为野生型sars-cov-2及各类变体的诊断与治疗提供了可能。
5.本发明提供了一种杂交瘤细胞株cov2-s2-g5，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为cctccno：c202293。
6.本发明提供了一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体g5，由所述杂交瘤细胞株cov2-s2-g5分泌得到。
7.本发明提供了所述抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体在制备以下至少一种产品中的应用，所述产品包括诊断或检测sars-cov-2病毒的试剂盒、预防或治疗由新冠病毒感染引起的疾病的药物和疫苗筛选用试剂。
8.优选的，所述sars-cov-2病毒包括野生型sars-cov-2病毒株和/或sars-cov-2病毒突变株。
9.优选的，所述sars-cov-2病毒突变株包括以下一种或多种：南非毒株、德尔塔毒株和奥密克戎毒株。
10.优选的，所述产品基于以下一种或多种技术检测：elisa技术、western blot技术、ifa技术和胶体金免疫检测技术。
11.优选的，所述抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体联合新冠病毒sars-cov-2广谱多肽抗原制备产品，所述广谱多肽抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示。
12.本发明提供了一种广谱中和sars-cov-2病毒的药品，包括所述单克隆抗体g5和医学上可接受的辅料。
13.本发明提供了一种基于免疫反应的新冠肺炎诊断用试剂盒，包括所述单克隆抗体g5和检测试剂。
14.本发明提供了一种sars-cov-2病毒疫苗筛选用试剂，包括所述单克隆抗体g5和辅料。
15.本发明提供了一种杂交瘤细胞株cov2-s2-g5，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为cctcc no：c202293。本发明使用抗原性较好的sars-cov-2s基因s2段多肽免疫动物，经细胞融合，筛选获得一株稳定分泌特异性好、效价高的单克隆抗体的杂交瘤细胞株cov2-s2-g5，并通过腹水制备及纯化，获得大量抗sars-cov-2s蛋白的单克隆抗体g5。与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：1)本发明的单克隆抗体是由单个细胞株产生，具有高度特异性、均一性等特性，单抗纯度高、特异性强、能持续无限的供应，在免疫检测中具有更广泛的研究应用价值和商业使用价值。2)本发明的单克隆抗体具有较强的反应性，在ifa、western blot以及elisa中与sars-cov-2的s蛋白反应性良好，可用于sars-cov-2的检测。3、本发明的单克隆抗体能有效中和sars-cov-2野生株与多种重要变体(包括南非株、德尔塔及奥密克戎)的s蛋白假病毒。因此，本发明不仅为建立针对新冠病毒相关抗原广谱检测方法提供了特异性单克隆抗体，还为开发新冠病毒广谱被动治疗药物提供了候选。
附图说明
16.图1为免疫沉淀试验检测4株单克隆抗体对sars-cov-2s蛋白的结合能力，泳道1：单抗b10，泳道2：单抗c10，泳道3：单抗g5，泳道4：单抗e2，泳道5：同种型抗体对照；
17.图2为elisa法检测单克隆抗体g5小鼠腹水效价；
18.图3为sds-page鉴定单克隆抗体g5亲和层析纯化结果；
19.图4为westernblot鉴定单克隆抗体g5与sars-cov-2s蛋白的反应性；
20.图5为ifa鉴定单克隆抗体g5与sars-cov-2s蛋白的反应性；
21.图6为单克隆抗体g5有效中和sars-cov-2野生型及三种重要变体的s蛋白假病毒。
22.生物材料保藏信息
23.杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，单位简称为cctcc，地址为中国武汉，武汉大学，保藏时间为2022年04月09日。保藏编号为cctccno：c202293，细胞株编号为cov2-s2-g5。
具体实施方式
24.本发明提供了一种杂交瘤细胞株cov2-s2-g5，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为cctccno：c202293。
25.本发明对杂交瘤细胞株cov2-s2-g5的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杂交瘤细胞株的制备和筛选方法即可。所述杂交瘤细胞株cov2-s2-g5制备过程中，所用的抗原为广谱多肽抗原(sars-cov-2s基因s2段)，氨基酸序列如seq id no:1所示。所述广谱多肽抗原在申请人先前申请的申请号为zl202110631147.0、发明名称为一种新冠病毒sars-cov-2广谱多肽抗原及其特异性中和抗体和应用的中国专利中披露。所述广谱多肽抗
原由上海杰肽生物科技有限公司合成。
26.本发明提供了一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体g5，由所述杂交瘤细胞株cov2-s2-g5分泌得到。
27.在本发明中，所述单克隆抗体g5采用间接elisa方法检测效价，g5的效价为1:512000，说明所述g5单抗具有较高的抗原结合能力。对g5单抗的亚类鉴定，单克隆抗体g5的重链亚类为igg1，轻链亚类为kappa。分别采用western blot技术、间接免疫荧光(ifa)以及elisa技术检测单克隆抗体g5对sars-cov-2的s蛋白的反应性，所述单克隆抗体g5与sars-cov-2的s蛋白反应性良好，可用于sars-cov-2的检测。因此，本发明提供了所述抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体在制备以下至少一种产品中的应用，所述产品包括诊断或检测sars-cov-2病毒的试剂盒、预防或治疗由新冠病毒感染引起的疾病的药物和疫苗筛选用试剂。
28.在本发明中，所述sars-cov-2病毒优选包括野生型sars-cov-2病毒和/或sars-cov-2病毒突变株。所述sars-cov-2病毒突变株优选包括以下一种或多种：南非毒株b.1.351、德尔塔毒株b.1.167.2和奥密克戎毒株b.1.1.529。所述产品优选基于以下一种或多种技术检测：elisa技术、western blot技术、ifa技术和胶体金免疫检测技术。所述抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体优选联合新冠病毒sars-cov-2广谱多肽抗原制备产品，所述广谱多肽抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示。
29.同时，本发明提供了一种广谱中和sars-cov-2病毒的药品，包括所述单克隆抗体g5和医学上可接受的辅料。本发明提供了一种基于免疫反应的新冠肺炎诊断用试剂盒，包括所述单克隆抗体g5和检测试剂。本发明还提供了一种sars-cov-2病毒疫苗筛选用试剂，包括所述单克隆抗体g5和辅料。本发明对所述药品、试剂盒以及试剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的相应产品的制备方法即可。
30.本发明制备出的单克隆抗体g5对新冠病毒及其变体具有良好的广谱中和效果，在广谱抗sars-cov-2感染治疗、疫苗研发和检测试剂盒研制中将具有良好的应用前景。
31.下面结合实施例对本发明提供的一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
32.实施例1
33.一种sars-cov-2广谱单克隆抗体g5的制备方法
34.委托上海杰肽生物科技有限公司人工合成氨基酸序列为seq id no:1(dplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdis)所示的多肽(该氨基酸序列在目前被鉴定的所有谱系的sars-cov-2中均保守)，作为免疫原用于动物免疫制备单克隆抗体，具体步骤如下：
35.1)将合成的多肽抗原经腹腔注射免疫4～6周龄雌性balb/c小鼠，50μg/只。多肽蛋白均与等体积的佐剂混匀乳化后进行免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂，第二、三次免疫则用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔2周。用多肽抗原建立的间接elisa方法检测三免后的小鼠血清抗体效价；其中间接elisa方法参考申请人在先申请并授权的专利(一种新冠病毒sars-cov-2广谱多肽抗原及其特异性中和抗体和应用，zl202110631147.0)。
36.2)挑选血清抗体效价最高的小鼠，腹腔注射50μg不加佐剂的多肽抗原进行冲击免疫，3日后取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞融合，将融合后细胞铺置于含小鼠腹腔巨噬细胞的
96孔板中，于37℃含5％co2的细胞培养箱培养9～11日，取上清用上述的间接elisa方法检测，将阳性细胞用有限稀释法进行亚克隆，直至全部为阳性，最终筛选获得了4株elisa强阳性的杂交瘤细胞，分别命名为g5、b10、c10和e2。
37.3)用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对4株单克隆抗体的亚类进行鉴定，结果：4株单克隆抗体的重链亚类均为igg1，轻链亚类均为kappa。
38.4)将4株杂交瘤细胞腹腔注射小鼠制备腹水，用于后续检测。
39.实施例2
40.检测4株单抗结合sars-cov-2s蛋白的能力
41.单抗g5具有最强的s蛋白结合能力：将转染sars-cov-2s蛋白的293t细胞裂解产物作为捕获抗原；将等量的4株单抗腹水分别和protein g beads于4℃混合3小时；用pbs洗涤3次后，进一步将抗体-beads混合物与等量的细胞裂解产物于4℃混合3小时；用pbs洗涤5次，加入蛋白上样缓冲液后，98℃煮样10min，样品经sds-page凝胶电泳分离后转印至nc膜；nc膜使用脱脂乳进行封闭后，用单抗g5作为一抗，与nc膜室温孵育2小时；pbst洗涤3次，用hrp标记的羊抗鼠igg二抗与nc膜室温孵育1小时；pbst洗涤3次后，加入ecl显色液，用化学发光仪进行检测。
42.结果：4株单抗均能拉下sars-cov-2s蛋白，其中分子量大的为s蛋白，小的为s2蛋白；但是单抗g5拉下的蛋白量显著高于其他3株单抗(图1)，而同种型抗体对照不能拉下sars-cov-2s蛋白。这一结果表明单抗g5对sars-cov-2s蛋白具有最强的结合能力。
43.实施例3
44.用实施例1中间接elisa方法检测g5单抗腹水的效价。
45.结果如图2所示。g5单抗腹水的效价为1:512000。
46.实施例4
47.用protein g亲和层析法纯化单克隆抗体g5的腹水，sds-page鉴定结果表明腹水纯化效果良好(图3)，随后用nanodrop测定纯化后抗体浓度为1.6mg/ml。
48.实施例5
49.sars-cov-2广谱单克隆抗体g5与病毒s蛋白的反应性
50.1)单克隆抗体g5具有良好的westernblot反应性：将转染sars-cov-2s蛋白的293t细胞裂解产物作为检测抗原，同时设置转染空载体的阴性对照；细胞裂解产物加入蛋白上样缓冲液后，98℃煮样10min，样品经sds-page凝胶电泳分离后转印至nc膜；nc膜使用脱脂乳进行封闭后，用单克隆抗体g5作为一抗，与nc膜室温孵育2小时；pbst洗涤3次，用hrp标记的羊抗鼠igg二抗与nc膜室温孵育1小时；pbst洗涤3次后，加入ecl显色液，用化学发光仪进行检测。
51.结果：在转染sars-cov-2s蛋白的细胞的泳道中可见2条明显的特异性条带，分子量大的为s蛋白，小的为s2蛋白(图4)，而阴性对照则没有特异性条带。这一结果表明单克隆抗体g5可通过western blot技术与sars-cov-2s蛋白反应。
52.2)单克隆抗体g5具有良好的ifa反应性：将转染sars-cov-2s蛋白的293t细胞作为抗原，细胞固定后pbs洗涤1次，加入单克隆抗体g5，同时设置转染空载体的阴性对照，置于37℃孵育45分钟；pbs洗涤3次，加入fitc标记的羊抗鼠igg二抗，37℃作用45分钟；pbs洗涤3次后于荧光显微镜下观察。
53.结果：转染sars-cov-2s蛋白的细胞孔中可见明显的亮绿色特异性荧光(图5)，而阴性对照孔无特异性绿色荧光。这一结果表明单克隆抗体g5可通过ifa技术有效识别sars-cov-2s蛋白。
54.实施例4
55.单克隆抗体g5有效抑制新冠及其变体s蛋白假病毒感染
56.采用新冠s蛋白假病毒中和试验检测单克隆抗体g5是否具有中和活性，具体流程如下：
57.1)将单克隆抗体g5按所需浓度稀释后与等量的sars-cov-2s蛋白假病毒(野生型wt、南非株b.1.351、德尔塔株b.1.167.2和奥密克戎株b.1.1.529)(假病毒均含gfp-luciferase报告基因，购自上海诺百生物科技有限公司)进行共孵育；
58.2)将孵育后的抗体-假病毒混合物接种稳定表达人ace2的293t细胞；
59.3)8小时后弃去细胞培养上清，换新鲜培养液继续培养；
60.4)病毒感染60小时后，用报告基因试剂盒检测细胞的luciferase荧光强度，并计算抑制率，结果如图6所示。
61.结果表明，本发明制备的单克隆抗体g5对sars-cov-2野生型wt、南非株b.1.351、德尔塔株b.1.167.2和奥密克戎株b.1.1.529均有较好的中和活性，能有效抑制病毒进入细胞。
62.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：1.一种杂交瘤细胞株cov2-s2-g5，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为cctcc no：c202293。2.一种抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体g5，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株cov2-s2-g5分泌得到。3.权利要求2所述抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体在制备以下至少一种产品中的应用，所述产品包括诊断或检测sars-cov-2病毒的试剂盒、预防或治疗由新冠病毒感染引起的疾病的药物和疫苗筛选用试剂。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述sars-cov-2病毒包括野生型sars-cov-2病毒株和/或sars-cov-2病毒突变株。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述sars-cov-2病毒突变株包括以下一种或多种：南非毒株、德尔塔毒株和奥密克戎毒株。6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述产品基于以下一种或多种技术检测：elisa技术、westernblot技术、ifa技术和胶体金免疫检测技术。7.根据权利要求3或6所述应用，其特征在于，所述抗sars-cov-2广谱中和性单克隆抗体联合新冠病毒sars-cov-2广谱多肽抗原制备产品，所述广谱多肽抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示。8.一种广谱中和sars-cov-2病毒的药品，其特征在于，包括权利要求2所述单克隆抗体g5和医学上可接受的辅料。9.一种基于免疫反应的新冠肺炎诊断用试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述单克隆抗体g5和检测试剂。10.一种sars-cov-2病毒疫苗筛选用试剂，其特征在于，包括权利要求2所述单克隆抗体g5和辅料。
技术总结本发明提供了一种抗SARS-CoV-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用，属于病毒检测技术领域。本发明筛选得到一株杂交瘤细胞株CoV2-S2-G5，分泌具有抗SARS-CoV-2广谱中和特性的单克隆抗体G5。所述单克隆抗体G5能有效中和SARS-CoV-2野生株以及多种突变毒株(包括奥密克戎突变株、德尔塔突变株和南非突变株)，为预防或治疗由新冠病毒感染引起的疾病的药物制剂、诊断新冠肺炎以及新冠病毒疫苗筛选提供了有效工具，具有极大的应用前景。的应用前景。的应用前景。
技术研发人员：叶建强 阚秋琪 李拓凡 秦爱建 万志敏 邵红霞 谢泉 张雯苑
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2022.04.18
技术公布日：2022/7/5
