1.本发明属于蛋白质工程技术领域，公开了一种活性及热稳定性提高的udp-葡糖基转移酶突变体及其应用。
背景技术：2.近年来，基于不断扩大的精细化合物市场以及用绿色生物法取代化学法的需求。一些难以从天然植物中提取的物质，传统提取工艺中通常会面临着产量低，能耗大等问题，而化学合成方法可能也无法合成一些天然大分子化合物。随着合成生物学、代谢工程等生物学领域的不断进步，生物酶法实现天然高价值化合物的可持续生产合成已成为行业趋势。
3.糖基转移酶(ec2.4.1.x)是一种普遍存在与生物体中的转移酶，在植物和微生物的次生代谢物合成中有重要的作用，催化糖基供体向受体分子进行糖基的转移。udp-葡糖基转移酶以udp-glucose为糖基供体，在黄酮类、生物碱类、萜类和低聚糖类化合物的生物生产中被广泛研究。葡糖基转移酶具有高度的区域选择性及立体选择性，并且其底物混杂性也使其拥有合成多种物质的能力。
4.甜叶菊叶片中提取的甜菊糖苷，作为一种甜度约为蔗糖200倍的天然代糖，其热量接近零，稳定性高，有望成为日常饮食中的甜味剂替代品。甜菊糖苷由于其分子结构中的甜菊醇，具有一定的后苦味，但其支链上葡糖基数量及结合位点均会影响其甜度及风味。目前市面上的甜菊糖产品主要成分为甜菊苷及莱鲍迪苷a，莱鲍迪苷d作为甜度及风味更优的甜菊糖苷成分，由于其在天然甜叶菊提取物中含量极少，不易提取，不利于其大规模生产应用。在天然合成途径中，葡糖基转移酶以udp-glucose及莱鲍迪苷a(reb a)为底物，可以合成莱鲍迪苷d(reb d)。
5.在实际应用中，酶的性质(如稳定性及酶活)影响工业生产的成本，不利于其推广及应用。因此对酶稳定性及催化活力的改造，是生物催化合成生产领域研究的重点。
技术实现要素：6.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种udp-葡糖基转移酶突变体。该突变体其耐热性及酶活显著提高，有利于其在甜菊糖合成领域的广泛应用。
7.本发明的另一目的在于提供上述葡糖基转移酶突变体的应用。
8.本发明利用rosettafold2进行ai建模，基于该模型对人参来源的udp-葡糖基转移酶进行定点突变，并基于该结果进行组合突变。提供了一种热稳定性及酶活更优的，可应用于莱鲍迪苷d和/或莱鲍迪苷e合成的udp-葡糖基转移酶突变体，具有重要的产业化价值和意义。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.本发明首要目的提供一种udp-葡糖基转移酶突变体，所述的突变体在seq id no.1所示氨基酸序列的野生型udp-葡糖基转移酶中突变至少一个氨基酸位点，包括：a11l、
f39y、s58g、s55p、n109k、a250e、i279l、v304l、t329i中的一个或几个组合。
11.在本发明的一些实施方案中，所述突变为a11l、或f39y、或s58g、或s55p、或n109k、或a250e、或i279l、或v304l、或t329i。
12.在本发明的一些优选实施方案中，所述突变为s55p/v304l、或s58g/v304l/t329i、或v304l/t329i/f39y/s55p、或v304l/t329i/f39y/s55p/n109k、或v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l、或v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/i279l、或v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/i279l/a250e、或v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/a250e。
13.本发明的第二个目的是提供编码上述udp-葡糖基转移酶突变体的基因，以能够使编码的udp-葡糖基转移酶较野生型具有更高的活力及热稳定性。
14.优选的，编码seq id no.1所示氨基酸序列的野生型udp-葡糖基转移酶的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明的第三个目的是提供含有所述udp-葡糖基转移酶突变体基因的重组表达载体。
16.本发明的第四个目的是提供含有上述udp-葡糖基转移酶突变体基因或上述重组表达载体的基因工程菌。
17.在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，进一步以大肠杆菌bl21(de3)为宿主。
18.本发明还提供所述udp-葡糖基转移酶突变体或所述基因工程菌在合成莱鲍迪苷d和/或莱鲍迪苷e中的应用。
19.优选的，以甜菊苷和/或莱鲍迪苷a为底物，合成莱鲍迪苷d和/或莱鲍迪苷e。
20.具体的，以甜菊苷为底物，合成莱鲍迪苷e；以莱鲍迪苷a为底物，合成莱鲍迪苷d。
21.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
22.本发明使用生物信息学手段，通过蛋白建模、结构分析等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面氨基酸，并进行单个或组合突变，得到的突变体较野生型udp-葡糖基转移酶热稳定性和酶活均显著提高，在甜味剂甜菊糖苷的工业化生产中应用，可提高生产效率，降低生产成本。
23.具体的，获得单点突变体酶a11l、s58g、v304l、s55p、f39y、t329i、a250e、n109k、i279l和组合突变体酶s55p/v304l、s58g/v304l/t329i、v304l/t329i/f39y/s55p、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/i279l、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/i279l/a250e、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/a250e。单点突变的酶活为野生型的110.3％～143.2％，组合突变体的酶活为野生型的154.3％～319.4％(甚至251.0％～319.4％)。组合突变体经40℃处理30min后，残余酶活为24.6％～82.7％(甚至66.8％～82.7％)，相较于野生型的11.6％有大幅提升，可更好应用于莱鲍迪苷d和/或莱鲍迪苷e的工业化生产，市场前景广阔。
附图说明
24.图1是以莱鲍迪苷a为底物催化合成莱鲍迪苷d的化学原理图。
25.图2是基于rosettafold2建立的蛋白三维结构。
26.图3是蛋白模型可信度拉氏分析图。
27.图4是突变体mut19及野生型在不同温度下孵育30min后的相对酶活对比；其中，(a)为野生型(wt)；(b)为突变体mut19。
28.图5是突变体mut19及野生型(wt)在35℃及40℃下孵育不同时间的酶活对比；其中，(a)为35℃；(b)为40℃。
29.图6是突变体mut19及野生型(wt)在35℃及40℃下反应20h的莱鲍迪苷d产量曲线图。
具体实施方式
30.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
31.本发明中a、l、s、g、v、p、f、y、t、i、e、n、k分别是丙氨酸ala、亮氨酸leu、丝氨酸ser、甘氨酸gly、缬氨酸val、脯氨酸pro、苯丙氨酸phe、酪氨酸tyr、苏氨酸thr、异亮氨酸ile、谷氨酸glu、天冬酰胺asn、赖氨酸lys的缩写。
32.实施例1 udp-葡糖基转移酶的蛋白结构预测分析
33.野生型氨基酸序列(如seq id no.1所示)利用rosettafold2在线预测软件进行蛋白结构建模(图2)，并用在线分析工具procheck对该模型进行可信度分析，拉氏构象图如图3所示。红色区域为高置信区域，模型中90.1％的氨基酸落在该区域；深黄色区域为高允许区，7.8％的氨基酸落在该区域；1％的氨基酸落在浅黄色低允许区。仅有四个氨基酸(1％)为白色的禁阻区。高比例的氨基酸位于红色和深黄色区域，说明该模型具有较高质量，可以用于进行后续分析研究。
34.实施例2预测位点的定点突变体库构建
35.利用fireprot在线预测网站对实施例1中获得的三维结构进行热稳定性提高的定点突变预测分析，基于结合能变化确定突变位点(表1)为a11l、s58g、v304l、s55p、f39y、t329i、a250e、n109k、i279l。将编码来源于人参的udp-葡糖基转移酶基因(如seq id no.2所示)通过ecori及noti连接于pet30a(+)载体中，得到重组表达载体pet30a-pu。设计引物在pet30a-pu上进行定点突变(表2)。
36.表1突变位点结合能变化预测
37.[0038][0039]
表2引物序列
[0040]
引物名称引物序列(5
′‑3′
)a11l-faatcagtatactgttgctaccatttttagca11l-rcagtatactgattctaccats58g-fggattcctctgctggtataaaactagttgags58g-raccagcagaggaatccttatv304l-faccagaggggtttctgcaaagggtaggagacv304l-rcagaaacccctctggtaaaas55p-faggataaggatccgtctgcttctataaaacs55p-rcggatccttatccttgatggf39y-ftgcaatgtttatctctgttctaccccaatcf39y-rataaacattgcaatttctt329i-fcattcaagcattggtgggtttgtgagccatt329i-raatgcttgaatgtcctaaaaa250e-fgacaaaagggaagaatctacagtggtgttta250e-rttcccttttgtcaagccagtn109k-fcttaaaaccttaaaacccgatttgcttatttn109k-rttttaaggttttaaggatttci279l-ftgggctagagctgagcacggttaatttcati279l-rcagctctagcccaattgcts58g/s55p-ftccgtctgctggtataaaactagttgagctts58g/s55p-raccagcagacggatcctta
[0041]
实施例3定点突变酶的大肠杆菌表达
[0042]
将实施例2中构建的点突变重组表达载体，转化入表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb卡那霉素平板上。将鉴定成功的阳性转化子接种于10ml lb培养基(含50mg/l卡那霉素抗生素)中37℃过夜培养。次日，将种子液按2％v/v的比例转接至100ml的lb培养基(含50mg/l卡那霉素抗生素)中，37℃培养至od
600
为0.6～0.8，加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，5mm)，于16℃培养26h。4℃，7000rpm离心收集培养后的菌体，并洗涤两次。超声破碎菌体，4℃，10000rpm离心30min获取粗酶液。利用镍离子亲和层析柱纯化粗酶液，获得纯酶，利用bradford方法测定蛋白浓度，以标准牛血清蛋白浓度测定标准曲线，测定纯酶蛋白浓度，在4℃冷藏备用。
[0043]
实施例4单点突变酶与野生型酶活检测及对比
[0044]
酶活测定反应体系(200μl)中含有底物5mm莱鲍迪苷a，2mm udp-glucose，50mm磷酸缓冲液(ph 7.5)，待测酶液20μl。将除待测酶液外的反应液分装于2ml ep管中于35℃预
热5min。加入酶液，35℃，400rpm反应10min。加入0.5m磷酸终止反应，5min后加入1m氢氧化钠溶液调节ph。12000rpm离心1min后，用0.22μm的水系滤头过滤上清至液相进样瓶中，用于高效液相色谱检测。其中以莱鲍迪苷a为底物催化合成莱鲍迪苷d的化学原理图，如图1所示。
[0045]
高效液相色谱检测条件为：
[0046]
色谱柱：athena c18-wp(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相为：68％磷酸二氢钠溶液(1.38g/l，ph2.6)，32％乙腈；流速：1ml/min；检测温度：40℃。
[0047]
9个突变位点与野生型的相对比酶活如表3所示。从表3中的数据可以看出，与野生型葡糖基转移酶相比，本发明所得突变体a11l、s58g、v304l、s55p、f39y、t329i、a250e、n109k、i279l的酶活较野生型均有提高，单点突变体酶活较野生型提高至1.10～1.43倍。
[0048]
表3野生型葡糖基转移酶与单突变体相对比酶活
[0049]
突变位点相对比酶活(％)野生型100a11l139.2f39y110.3s55p126.7s58g143.2n109k132.8a250e123.2i279l120.9v304l122.0t329i125.5
[0050]
实施例5单点突变酶与野生型热稳定性对比
[0051]
将实施例3中所得酶液与野生型的纯酶液，共同分别放置在40℃中水浴30min后。按照实施例4的方法测定热处理后残余酶活。实验得到9个突变体的耐热性，如表4所示，本发明的单点突变体提高酶活的基础上，除s58g与野生型的热稳定性相近外，a11l、f39y、s55p、n109k、a250e、i279l、v304l、t329i热处理后的剩余酶活为17.1～21.4％，高于野生型的11.3％。
[0052]
表4野生型葡糖基转移酶与突变体的耐热性比较
[0053]
突变位点40℃孵育30分钟残余酶活(％)野生型11.3a11l17.1f39y17.5s55p20.2s58g10.1n109k18.0a250e21.4i279l21.2v304l26.3
t329i19.9
[0054]
实施例6位点组合突变
[0055]
为进一步提高野生型蛋白pu的催化活力及热稳定性，进一步将a11l、s58g、v304l、s55p、f39y、t329i、a250e、n109k、i279l进行组合突变。根据实施例3步骤获得纯酶，并进行酶活检测。并根据实施例4的做法，检测组合突变的热稳定性。实验获得酶活显著提高的组合突变体，分别命名为mut1、mut2、mut5、mut12、mut17、mut18、mut19、mut21。如表5、6所示，组合突变体酶活较野生型提高1.54～3.19倍，甚至2.51～3.19倍；组合突变体热处理后的剩余酶活为24.6％～82.7％，甚至66.8％～82.7％，相较于野生型的11.6％有大幅提升。
[0056]
其中，mut1包含的突变位点为：s55p、v304l；
[0057]
mut2包含的突变位点为：s58g、v304l、t329i；
[0058]
mut5包含的突变位点为：v304l、t329i、f39y、s55p；
[0059]
mut12包含的突变位点为：v304l、s55p、f39y、t329i、n109k；
[0060]
mut17包含的突变位点为：v304l、s55p、f39y、t329i、n109k、a11l；
[0061]
mut18包含的突变位点为：v304l、s55p、f39y、t329i、n109k、a11l、i279l；
[0062]
mut19包含的突变位点为：v304l、t329i、f39y、s55p、n109k、a11l、i279l、a250e；
[0063]
mut21包含的突变位点为：v304l、t329i、f39y、s55p、n109k、a11l、a250e；
[0064]
表5野生型葡糖基转移酶与组合突变体相对比酶活
[0065]
突变位点相对比酶活(％)野生型100mut1154.3mut2165.2mut5186.1mut12236.0mut17272.2mut18302.8mut19319.4mut21251.0
[0066]
表6野生型葡糖基转移酶与组合突变体的耐热性比较
[0067]
突变位点40℃孵育30分钟残余酶活(％)野生型11.6mut124.6mut227.9mut521.5mut1235.5mut1766.8mut1873.0mut1982.7mut2175.6
[0068]
实施例7突变体mut19及野生型的酶学性质检测
[0069]
配置终浓度含有0.1～1.8mm(梯度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1、1.2、1.6、1.8mm)莱鲍迪苷a，2mm udp-glucose，50mm磷酸缓冲液(ph 7.5)的反应液。将除酶液外的反应液分装于2ml ep管中于35℃预热5min。加入0.02mg/ml纯酶，35℃，400rpm反应10min。加入0.5m磷酸终止反应，5min后加入1m氢氧化钠溶液调节ph。12000rpm离心1min后，用0.22μm的水系滤头过滤上清至液相进样瓶中，用于高效液相色谱检测。与野生型相比(表7)，组合突变体mut19的k
cat
/km值提高了1.14倍，说明突变后的酶催化效率提高，更有利于其工业应用。
[0070]
表7野生型与mut19的酶学性质
[0071]
酶k
cat
(min-1
)km(mm)k
cat
/km(min-1
·
mm-1
)野生型22.1
±
1.90.12
±
0.0047184.2mut1982.8
±
4.70.21
±
0.0046394.3
[0072]
实施例8突变体mut19与野生型在不同温度下的热稳定性对比
[0073]
将相同蛋白浓度的mut19与野生型酶液放置于25～50℃下孵育30min。加入预热至35℃，根据实施例4进行酶活检测。结果如图4所示。与野生型相比，mut19在35℃下孵育30min后，酶活仍残留97％以上。45℃及50℃条件下，野生型孵育30min后酶活几乎完全丧失，但mut19在相同情况下，45℃下仍残留83.3％酶活，50℃下保留15.4％酶活。
[0074]
实施例9突变体mut19与野生型在相同温度下不同时间的酶活对比
[0075]
将相同蛋白浓度的mut19与野生型酶液，分别放置在35与40℃下孵育不同的时间。根据实施例4进行酶活检测。结果如图5所示。在35℃下孵育2h，野生型的酶活降低至未进行孵育酶活的39％，但mut19酶活依旧保持在93％以上。在40℃下，野生型孵育1h即丧失所有酶活，但mut19在孵育2h后仍保留超过59％的酶活。
[0076]
实施例10突变体mut19在莱鲍迪苷d合成中的应用
[0077]
配置终浓度含有4mm莱鲍迪苷a，4mm udp-glucose，50mm磷酸缓冲液(ph 7.5)的反应液。将除酶液外的反应液分装于2ml ep管中于35℃或40℃预热5min。加入0.01mg/ml纯酶，35℃或40℃，400rpm反应20h，反应过程中取出200μl反应液用于检测。加入0.5m磷酸终止反应，5min后加入1m氢氧化钠溶液调节ph。12000rpm离心1min后，用0.22μm的水系滤头过滤上清至液相进样瓶中，用于高效液相色谱检测。结果如图6所示。野生型在40℃条件下反应20h，反应5h后，莱鲍迪苷d的产量几乎不再增加，最终产量为2.04mm。在35℃下，野生型在反应10h后，产物增长速率趋于平缓，最终产量为2.75mm。与野生型相比，mut19在35℃及40℃下，莱鲍迪苷d产量始终高于野生型，且mut19在40℃下反应较35℃更优。40℃反应20h后，mut19的产量为3.81mm，转化率为95.3％。
[0078]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种udp-葡糖基转移酶突变体，其特征在于：所述的突变体在seq id no.1所示氨基酸序列的野生型udp-葡糖基转移酶中突变至少一个氨基酸位点，包括如下突变中的一个或几个：a11l、f39y、s58g、s55p、n109k、a250e、i279l、v304l、t329i。2.根据权利要求1所述的udp-葡糖基转移酶突变体，其特征在于：所述突变为a11l、f39y、s58g、s55p、n109k、a250e、i279l、v304l、t329i、s55p/v304l、s58g/v304l/t329i、v304l/t329i/f39y/s55p、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/i279l、v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/i279l/a250e或v304l/t329i/f39y/s55p/n109k/a11l/a250e。3.编码权利要求1或2所述udp-葡糖基转移酶突变体的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：编码野生型udp-葡糖基转移酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体。6.含有权利要求3～4任一项所述基因或权利要求5所述重组表达载体的基因工程菌。7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。8.权利要求1～2任一项所述udp-葡糖基转移酶突变体、权利要求3～4任一项所述基因、权利要求5所述重组表达载体或权利要求6～7任一项所述基因工程菌在合成莱鲍迪苷d和/或莱鲍迪苷e中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：以甜菊苷和/或莱鲍迪苷a为底物，合成莱鲍迪苷d和/或莱鲍迪苷e。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：以甜菊苷为底物，合成莱鲍迪苷e；以莱鲍迪苷a为底物，合成莱鲍迪苷d。
技术总结本发明公开一种葡糖基转移酶突变体及其应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明使用生物信息学手段，通过蛋白建模、结构分析等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面氨基酸，并进行单个或组合突变，得到的突变体在SEQID NO.1所示氨基酸序列的野生型UDP-葡糖基转移酶中突变A11L、F39Y、S58G、S55P、N109K、A250E、I279L、V304L和T329I中的至少一个位点。得到的突变体较野生型UDP-葡糖基转移酶热稳定性和酶活均显著提高，在甜味剂甜菊糖苷(莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E)的工业化生产中应用，可提高生产效率，降低生产成本，市场前景广阔。市场前景广阔。市场前景广阔。
技术研发人员：林影 陈美琪 梁书利 韩双艳 郑穗平
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/7/5
