1.本发明属于医用技术领域，涉及一种稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂及其制备方法和应用。
背景技术：2.迄今为止，癌症仍是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一。实现癌症的早期诊断和有效治疗是提高患者治愈率和存活率的重要手段，也是癌症医学和临床诊断领域的研究热点。稀土掺杂的无机发光材料(renps)可以在近红外光的激发下发射出可见光或近红外光，这种材料已经广泛的应用在生物传感、生物成像及药物释放等，尤其是多模态功能在纳米诊疗剂在生物应用中尤为重要。这就要求纳米诊疗剂不仅具有治疗目的，而且能实时诊断监测的功能。
3.近年来光动力治疗因为其易于操作、高准确性、对周围健康组织伤害较小等特点，越来越受到癌症治疗的青睐。相比于传统光敏剂在水溶液易发生荧光自淬灭现象，聚集诱导发光型(aie)光敏剂能在聚集状态下表现出高亮度和强单线态氧生成能力。而稀土掺杂的上转换纳米颗粒(ucnps)通过非线性反斯托克斯机制，能将低能近红外(nir)光转换为更高能量的可见光/紫外光，因此将其与光敏剂连用可克服传统光动力治疗组织穿透深度不足的问题。
4.光学成像可用于实现组织和病理过程的动态监测，在生物医学检查辅助诊断和手术治疗中已显示出巨大的应用潜力。相比于传统的生物光学成像方法主要在可见光(400-700nm)和近红外波长(700-900nm)的nir-i光谱区域内操作，nir-ii光学成像可以实现更低的组织自发荧光、光子散射和吸收，并具有更高的信噪比和更深的生物组织渗透率。其中，稀土掺杂的下转换纳米颗粒(dcnps)因为其具有窄的多峰发射曲线、大的斯托克斯位移、深入的软组织穿透力和良好的光稳定性，已被认为是一种有前途的nir-ii荧光探针。
技术实现要素：5.本发明的发明目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供一种在激光辐照下能同时产生上/下转化发光，与光敏剂及靶向多肽协同实现肿瘤的光动力治疗及近红外ii区成像的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂。
6.为实现上述发明目的，本发明通过如下方案实现：一种稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，所述纳米靶向诊疗剂包含稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)、聚集诱导型光敏剂(aie pss)以及神经肽y1配体多肽(npy)。
7.本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂中的稀土上/下转化发光纳米粒子在808nm激光辐照下同时产生上/下转化发光，与光敏剂及靶向多肽协同实现肿瘤的特异性光动力治疗及近红外ii区荧光成像。
8.作为优选，所述稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的平均粒径为10-100纳米。
9.在上述稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂中，所述的稀土上/下转化发光纳米粒子
mpeg
2000
)与renps@aie pss混合物的质量比为1：1～10。
22.稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的制备方法中，y1配体多肽(npy)与renps@aie pss混合物的质量比为1：1～30。
23.本发明还提供稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂在光动力治疗以及在近红外ii区荧光成像的应用。
24.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
25.(1)本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂具有出色的光动力杀伤效果，可改善传统光动力治疗组织穿透深度不足的问题，实现深部肿瘤区域的光动力治疗；
26.(2)本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂能实现在近红外ii区的荧光成像，并具有更高的信噪比和更深的生物组织渗透率，实现肿瘤的精准靶向定位；
27.(3)本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂相对于单一的稀土上转化或下转化材料或被动靶向纳米诊疗剂，其在单波长激发下实现高效集约化的特异性肿瘤、癌症诊疗一体化应用，利用荧光可视化实时监测纳米药物治疗过程以及反馈纳米药物治疗效果，一定程度上提高了癌症治疗的药物疗效和安全性，且具有更优异的抑制肿瘤生长的治疗效果。
28.(4)本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的制备简单，粒径较为均一，亲水性、光稳定性、生物相容性均较好；稀土上/下转化发光纳米粒子在808nm激光辐照下同时产生上/下转化发光，与光敏剂及靶向多肽协同实现肿瘤的特异性光动力治疗及近红外ii区荧光成像。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案的区别，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明稀土上/下转化发光纳米粒子nagdf4nd3yb2tm1(c1)的透射电镜图；
31.图2为本发明实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的透射电镜图；
32.图3为本发明稀土上/下转化发光纳米粒子nagdf4nd3yb2tm1(c1)的xrd谱图；
33.图4为本发明稀土上/下转化发光纳米粒子nagdf4nd3yb2tm1(c1)和实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂(图中为d1)的荧光光谱图；
34.图5为本发明实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的近红外ii区荧光图像；
35.图6为本发明实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的小鼠活体近红外ii区荧光图像；
36.图7为本发明实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的光动力治疗抑制肿瘤效果考察结果图。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创
造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。如无特别说明，本发明的实施例中的原料均通过商业途径购买。而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
38.本发明诊疗剂中的稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)采用高温分解法制备，具体可以通过如下步骤制备：
39.s1、将gdcl3·
6h2o(0.94mmol)、ndcl3·
6h2o(0.03mmol)、ybcl3·
6h2o(0.02mmol)、tmcl3·
6h2o(0.01mmol)放入装有6ml油酸和15ml十八烯的三口瓶中，中速搅拌，加热至140℃，保温60min，自然冷却至室温，得到反应液；
40.s2、将2.5mmol naoh和4.0mmol nh4f分别溶解在6ml甲醇中，并将两种溶液迅速混合并振荡15s后，立即加入到反应液中，30℃保温50min；
41.s3、将反应液缓慢加热升温至100℃，同时向反应液中通入n2，持续30min，排除甲醇和水蒸气。再将反应液升温至280℃(升温速率：15℃/min)，保温60min；
42.s4、反应完成后自然冷却至室温，加入适量无水乙醇沉淀、8000rpm离心6min，得到nagdf4nd3yb2tm1稀土上/下转化发光纳米粒子，其透射电镜图及xrd谱图参见图1、图3。由nagdf4nd3yb2tm1的透射电镜图(图1)可得，该纳米粒子形貌一致，粒径均一，在10-20nm之间。x射线衍射图谱(图3)结果显示，该纳米微粒的衍射峰与nagdf4的标准图谱jcpds card no.27-0699基本保持一致，无杂质峰出现，且结晶性良好,由此证明该纳米颗粒合成成功。
43.通过上述稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)的制备方法，区别在于掺杂元素含量不同，分别制备c2-c4的发光纳米粒子，c1-c4的具体成分配比如下表1所示。
44.表1
45.名称稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)c1nagdf4(nd
3+
,3％)(yb
3+
,2％)(tm
3+
,1％)c2ligdf4(nd
3+
,4％)(yb
3+
,2％)(tm
3+
,2％)c3nayf4(nd
3+
,3％)(yb
3+
,4％)(tm
3+
,2％)c4klaf4(nd
3+
,6％)(yb
3+
,3％)(tm
3+
,5％)
46.实施例1-28
47.一种稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，分别包含如表2实施例1-28中的稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)、聚集诱导型光敏剂(aie pss)以及神经肽y1配体多肽(npy)。
48.其中实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的透射电镜图及荧光光谱如图2、图4。从图2中可得实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂形貌统一，分散性良好，粒径均一，且控制在20-30纳米之间。从图4的荧光光谱可进一步证明该稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂制备成功，且同时具备光动力治疗和近红外二区成像的应用潜力。
49.表2
[0050][0051]
实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂(nagdf4nd3yb2tm1@tind-npy)通过如下方法制备：
[0052]
s1、取10mgnagdf4nd3yb2tm1(即c1)、1mg tind分散于10ml氯仿中；另取40mgdspe-mpeg
2000
、4mg dspe-mpeg
2000-npy分散于10ml氯仿中；
[0053]
s2、将上述两种分散液进行混合，搅拌5～30min；旋转蒸发在chcl3溶液中形成薄膜，然后在真空下干燥过夜；
[0054]
s3、将干燥的脂质膜用去离子水水合，后将分散液用超滤离心管(mw＝3000da)离心过滤，除去游离的tind，得到稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂nagdf4nd3yb2tm1@tind-npy溶液。其透射电镜图及荧光光谱参见图2、图4。从图2可得该靶向诊疗剂形貌统一，分散性良好，粒径均一，控制在20-30nm之间。从图4的荧光光谱分析可得，该纳米靶向诊疗剂相较于纯nagdf4nd3yb2tm1(renps)纳米颗粒，其上转化部分的荧光强度明显减弱，这表明tind充分吸收了renps产生的上转化荧光，同时下转化部分荧光并未明显减弱，进一步说明该纳米靶向诊疗剂制备成功。
[0055]
实施例2-28中的纳米靶向诊疗剂也可通过如上方法制得。
[0056]
本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂应用广泛，具体可以用于细胞光动力治疗、nir-ii荧光成像、体内光动力治疗，具体如下：
[0057]
1、细胞光动力治疗
[0058]
为了研究光动力效应对细胞活性的影响，其实验操作如下：
[0059]
1)在96孔板接种u87-mg细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中培养24小时；
[0060]
2)将不同浓度梯度的材料(d1-d30)与细胞孵育1-12小时，用808nm激发光进行光照后于培养箱中培养1-6小时；
[0061]
3)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0062]
4)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0063]
5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0064]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0065]
其中，as:实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0066]
ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0067]
ab:空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0068]
细胞光动力治疗的实验结果如表3所示。
[0069]
表3
[0070][0071][0072]
注：当药物浓度为100微克/毫升时，++++表示存活率小于30％；+++表示存活率30～50％；++表示存活率50％～70％；+表示存活率大于70％。
[0073]
由此可知，本发明稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂对不同npy过表达的细胞呈现良好的细胞光动力治疗效果。
[0074]
2、nir-ii荧光成像
[0075]
使用苏州影睿光学科技公司的近红外二区活体荧光成像系统进行近红外二区的荧光成像。使用ingaas相机，以及连续激光器808nm光纤作为激发光源，切换lp900滤片进行可见光区域的荧光过滤。实施例1中的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂以及其尾静脉注射原位脑胶质瘤小鼠活体的荧光成像分别如图5、图6所示。表明实施例1中的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂在808nm激光辐照下具有较为明亮的荧光，且与浓度呈正相关。通过尾静脉注射入小鼠体内后，实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂(图中d1)在小鼠脑部可实现近
红外二区成像，且能清晰看到脑胶质瘤的位置。
[0076]
3、光动力治疗抑制肿瘤效果考察
[0077]
将使用u87-mg-luc建立原位脑胶质瘤的小鼠(两周左右)，分为pbs+光照组和实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂(图中d1)+光照组。在尾静脉分别注射100ul且8-10h后，用808nm激光进行辐照。随后每隔5天通过生物发光成像信号强度监测脑胶质瘤的生长情况并观察记录小鼠的生存状态。光动力抑制小鼠原位脑胶质瘤的生长情况如图7所示。通过小鼠的生物发光信号强度数据分析，相比于对照组的脑胶质瘤呈快速增长模式，实施例1中稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂(图中d1)的光动力治疗对脑胶质瘤的生长具有明显的抑制效果，进一步说明该纳米靶向诊疗剂对脑胶质瘤具有良好的光动力治疗效果。
[0078]
综上所述，本发明纳米靶向诊疗剂在单波长808nm激光辐照下可同时产生上/下转化发光，能够实现特异性肿瘤的光动力治疗及近红外ii区荧光成像，集诊断治疗于一体化。相对于传统单一的药物，其达到实现一种纳米诊疗剂的多功能化应用，疗效诊断更加精确，因此对于临床精确治疗诊断方面有着广阔的应用前景，为肿瘤的及早发现及治疗提供了新的思路。
[0079]
以上为本发明所述的具体实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，所述纳米靶向诊疗剂包含稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)、聚集诱导型光敏剂(aie pss)以及神经肽y1配体多肽(npy)。2.根据权利要求1所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，所述的稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)具有式ⅰ通式：nare1f4(nd
3+
,n1％)(yb
3+
,n2％)(tm
3+
,n3％)式ⅰ，其中，a选自li、na和k中的一种或多种；re1选自y、la和gd中的一种或多种；0<n(n1、n2、n3)≤100。3.根据权利要求2所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，稀土上/下转化发光纳米粒子(renps)中1<n1≤10；1<n2≤10；0<n3≤5。4.根据权利要求1或2或3所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，所述稀土上/下转化发光纳米粒子为ligdf4(nd
3+
,4％)(yb
3+
,2％)(tm
3+
,2％)、nayf4(nd
3+
,3％)(yb
3+
,4％)(tm
3+
,2％)、klaf4(nd
3+
,6％)(yb
3+
,3％)(tm
3+
,5％)或nagdf4(nd
3+
,3％)(yb
3+
,2％)(tm
3+
,1％)。5.根据权利要求1所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，所述的聚集诱导发光型光敏剂(aie pss)最大吸收波长在500-700nm范围内。6.根据权利要求1或5所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，所述的光敏剂包括tbt、tpetcaq、tfm、qcn、tind、ttd中的任意一种或多种。7.根据权利要求1所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂，其特征在于，所述的神经肽y1配体多肽包括以下肽段中的一种或多种：npy、npy(28-36)、pnpy、[arg6,pro34]pnpy、[phe6,pro34]pnpy、[asn6,pro34]pnpy、[cys6,pro34]pnpy、[phe7,pro34]pnpy、[pro30,nle31,bpa32,leu34]npy(28-36)、[arg7,pro34]pnpy、[leu31,pro34]pnpy、pyy(3-36)、[ahx5-24]npy、[ala31,aib32]pnpy、hpp、[cpp1-7,pnpy19-23,ala31,aib32,gln34]hpp、npy(3-36)、npy(22-36)、[pro30,tyr32,pro34]npy(25-36)、[pro30,tyr32]npy(25-36)、[asn28,pro30,trp32]npy(25-36)、[pro30,tyr31,trp32]npy(25-36)、npy(25-36)、[leu31,pro34]pnpy、pyy(3-36)、[32-34βacc]-npy(25-36)、[ahx 5-24]npy、[gln34]-hpp。8.一种如权利要求1所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：将稀土上/下转换纳米粒子(renps)与聚集诱导型光敏剂(aie pss)分子结合，形成renps@aie pss混合物；并采用偶联聚乙二醇(dspe-mpeg
2000
)、y1配体多肽(npy)进行修饰，得到renps@aie pss-npy复合物。9.根据权利要求8所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂的制备方法，其特征在于，偶联聚乙二醇(dspe-mpeg
2000
)与renps@aie pss混合物的质量比为1：1～10，y1配体多肽(npy)与renps@aie pss混合物的质量比为1：1～30。10.如权利要求1所述的稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂在光动力治疗或近红外ii区荧光成像的应用。
技术总结本发明属于医用技术领域，涉及一种稀土上/下转化纳米靶向诊疗剂及其制备方法和应用。其包含稀土上/下转化发光纳米粒子、聚集诱导型光敏剂以及神经肽Y1配体多肽(NPY)，稀土上/下转化发光纳米粒子具有式Ⅰ通式：NaRe1F4(Nd
技术研发人员：李娟 何雪璐 吴爱国
受保护的技术使用者：宁波慈溪生物医学工程研究所
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/7/4
