1.本发明涉及一种细胞色素c氧化酶，涉及人结直肠癌预后的预测性生物标志物cox4i2，属于生物医学技术领域。
背景技术：2.结直肠癌(crc)是一种常见的消化道肿瘤，在恶性肿瘤中发病率排名第三，在癌症中致死率排名第二。它的发病机制很复杂，涉及众多的易感因素，并与遗传、饮食和生活习惯有关。统计显示，30％-50％的crc肿瘤在手术后复发并出现远处转移，尤其是肝脏、肺部、骨骼和卵巢，五年生存率往往不超过10％。
3.肿瘤的生长和转移需要血管的滋养，而肿瘤的新生血管是肿瘤微环境的一个特征。低氧微环境破坏了血管相关因子的平衡，激活了内皮细胞，增加了血管的通透性，促进了营养物质向癌细胞的输送，增强了癌细胞的迁移和增殖，导致肿瘤的发展。近年来，抗血管生成疗法，如贝伐单抗和瑞戈非尼，已被广泛用于crc。然而，肿瘤相关血管的形成涉及多个基因和信号通路的作用，其调控机制广泛而复杂，相对来说，只有少数患者能从抗血管生成治疗中获益。因此，筛选合适的目标人群和与抗血管生成治疗相关的预后标志物尤为重要。
4.细胞色素c氧化酶(cox)是呼吸链的最后一种酶，负责催化电子与氧气(o2)的转移。线粒体cox基因编码的催化亚单位与核基因编码的结构亚单位复合在一起。亚单位4是其中最大的一个，参与线粒体呼吸链，在不同的氧浓度下优化呼吸效率。因此，哺乳动物细胞通过改变cox亚单位的组成来应对缺氧环境。cox4i1和cox4i2的水平都受氧浓度的调节：在正常浓度下，cox4i1的水平上升，而cox4i2的水平下降。在缺氧条件下，缺氧诱导因子(hif)诱导cox4i2的表达，从而提高cox4i2的水平，改变线粒体的膜电位，并提高atp和活性氧(ros)的水平。ros水平与血管生成有关，包括刺激内皮细胞的生长和迁移，以及调节血管内皮生长因子(vegf)、其受体、核因子κb(nf-κb)、丝裂原激活蛋白激酶(mapk)和基质金属蛋白酶(mmps)的水平。众所周知，缺氧与肿瘤进展和预后不良有关。然而，在缺氧条件下上调的cox4i2在肿瘤进展中的作用还不太清楚。
技术实现要素：5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有临床诊断中对结直肠癌患者预后判断的生物标志物准确性低、对结直肠癌患者转移预判能力的不足。通过对cox4i2深入研究，表明cox4i2参与调控结直肠癌细胞上皮-间质转化(emt)，并且cox4i2可通过升高成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,fgf1)的表达水平，促进血管内皮细胞的招募及血管形成以及肿瘤相关成纤维细胞的招募及激活。
6.本发明通过大量的转录组数据筛选和临床标本验证，表明cox4i2可作为人结直肠癌转移的预测性生物标志物，或者人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒成
分。
7.技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
8.一种人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物，它属于细胞色素c氧化酶家族gene cards gene symbol:cox4i2。
9.一种人结直肠癌免疫治疗反应性的预测性生物标志物，它属于细胞色素c氧化酶家族gene cards gene symbol:cox4i2。
10.一种人结直肠癌预后的预测或免疫治疗筛查的试剂盒，它包括cox4i2蛋白。
11.本发明提供的一种人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒，所述的cox4i2蛋白的氨基酸序列为：
12.mlpraawslvlrkggggrrgmhssegttrgggkmspytncyaqryypmpeepfctelnaeeqalkekekgswtqlthaekvalyrlqfnetfaemnrrsnewktvmgcvfffigfaalviwwqrvyvfppkpitltderkaqqlqrmldmkvnpvqglasrwdyekkqwkk。即：
13.met-leu-pro-arg-ala-ala-trp-ser-leu-val-leu-arg-lys-gly-gly-gly-gly-arg-arg-gly-met-his-ser-ser-glu-gly-thr-thr-arg-gly-gly-gly-lys-met-ser-pro-tyr-thr-asn-cys-tyr-ala-gln-arg-tyr-tyr-pro-met-pro-glu-glu-pro-phe-cys-thr-glu-leu-asn-ala-glu-glu-gln-ala-leu-lys-glu-lys-glu-lys-gly-ser-trp-thr-gln-leu-thr-his-ala-glu-lys-val-ala-leu-tyr-arg-leu-gln-phe-asn-glu-thr-phe-ala-glu-met-asn-arg-arg-ser-asn-glu-trp-lys-thr-val-met-gly-cys-val-phe-phe-phe-ile-gly-phe-ala-ala-leu-val-ile-trp-trp-gln-arg-val-tyr-val-phe-pro-pro-lys-pro-ile-thr-leu-thr-d-glu-arg-lys-ala-gln-gln-leu-gln-arg-met-leu-d-met-lys-val-asn-pro-val-gln-gly-leu-ala-ser-arg-trp-d-tyr-glu-lys-lys-gln-trp-lys-lys。
14.有益效果：
15.本发明通过大量实验筛选，通过对cox4i2蛋白深入研究，表明cox4i2的激活可显著诱导成纤维细胞生长因子1(fgf1)的表达，从而促进肿瘤相关的血管生成和癌症相关的成纤维细胞(cafs)的激活，促进crc进展。因此，cox4i2蛋白可作为直肠癌预后的预测或免疫治疗筛查的标志物，也可以作为治疗靶点，具有重要的应用价值。
附图说明
16.图1为lasso和cox回归模型。图中(a)为lasso(最小绝对收缩和选择算子)cox模型拟合。每条曲线代表一个基因。绘制了系数对log(λ)的曲线。垂直线表示通过10倍交叉验证确定的系数大于0的7个基因的位置。(b)为λ由10倍交叉验证确定。x轴代表log(λ)；y轴代表二项式偏差。由最小标准和标准的一个标准误差计算出的最佳值用垂直虚线表示。单变量森林图(c)和多变量森林图(d)显示了cox表达和与crc中os相关的临床特征之间的关联。单变量森林图(e)和多变量森林图(f)显示了cox表达与crc中与dss相关的临床特征之间的关联。单变量森林图(g)和多变量森林图(h)显示了cox表达和与crc中pfi相关的临床特征之间的关联。
17.图2为cox4i2的过表达促进了crc的恶性发展结果图。图中(a)分析ihc结果和crc和对照组织中的cox4i2水平(n＝30)。(b)通过westernblotting显示肿瘤(t)和配对的正常
组织(n)中的cox4i2水平(n＝30)。(ns：不显著，*p《0.05，**p《0.01，和***p《0.001)。(c)正常人结肠上皮细胞和crc细胞系中的cox4i2蛋白水平。(d)通过gfp表达和westernblotting显示转染效率(％)。(e)用nc、sh-cox4i2和oe-cox4i2构建体转染的crc细胞的克隆形成。(f)小鼠异种移植肿瘤(每组6只小鼠)。(g)每周两次测量异种移植肿瘤的体积。(h)研究结束时异种移植肿瘤的重量。(i-j)异种移植肿瘤(n＝24)和crc组织(n＝30)中cox4i2和ki-67的ihc染色强度的相关性。测量来自不同的样本。(k)转染48小时后crc细胞的培养上清液中的fgf1蛋白水平，通过酶联免疫吸附剂测定(elisa法)测量。(l)小鼠血清中的fgf1水平，用elisa法测定。测量取自不同的样本(n＝6)。(m)小鼠异种移植肿瘤组织中fgf1蛋白的ihc染色。(n)crc和正常组织中cox4i2和fgf1蛋白水平。
18.(o)crc中cox4i2和fgf1之间的相关性。统计分析通过χ2检验进行。r，pearson相关系数。数据以平均值
±
sem表示，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
19.图3为cox4i2的过量表达通过影响上皮-间质转化(emt)促进crc细胞的侵袭和转移结果，图中(a)细胞侵袭(transwell试验)。(b)细胞迁移(划痕试验)。(c)cox4i2和emt相关基因之间的相关性。(d)emt相关的蛋白质通过westernblotting法显示。数据以平均值
±
sem表示，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001。
20.图4为cox4i2的过量表达促进了crc的血管生成和caf的激活结果。图中(a)huvec迁移试验的模式图。(b-c)人脐静脉内皮细胞(huvec)迁移分析(transwell试验)。(d)小管形成试验的模式图。(e-f)huvec管的形成和显示不同组的管形成指数的图表。(g)mscs和crc细胞的非接触共培养。细胞以1：1的比例使用。(h-i)westernblot显示共培养4天后的cafs相关标志物。(j-l)mscs与crc细胞(对照组细胞和转染了nc、sh-cox4i2和oe-cox4i2构建体的crc细胞)共同培养时，用或不用5μm pd-166866处理的免疫荧光(放大率，
×
400)。(m)cafs迁移试验。(n-o)crc细胞对caf的招募(transwell)(放大率
×
200)。数据表示为平均值
±
sem，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
22.实施例1确定细胞色素c氧化酶中的价值基因
23.本发明研究将所有42个细胞色素c氧化酶相关基因进行lasso回归，以确定后续研究的目标基因。交叉验证分10轮进行，以防止过度拟合(图1a和b)。进行了连续的单变量和多变量cox回归分析，显示cox4i2和cox19都与crc预后有关，确定这些基因为研究目标(图1c-h)。
24.实施例2 cox4i2促进结直肠癌的恶性表型
25.本发明利用westernblotting和ihc(免疫组化)探讨了cox4i2在crc组织中的表达，表明在crc细胞和组织中cox4i2的水平都很高。在crc和配对的对照组织中，cox4i2表达的平均h-scores分别为95.53
±
15.96和19.14
±
6.65(图2a-c)。cox4i2的水平在rko和sw480细胞系中最高，因此这些细胞系被用于进一步研究。转染的效率通过gfp表达和westernblotting确认(图2d)。沉默的cox4i2减少了克隆的形成(图2e)。此外，稳定的
cox4i2过表达导致小鼠异种移植肿瘤的成功形成(图2f-h)。ki-67(一种核增殖标志物，是检测肿瘤细胞增殖活性指标)是已知的crc预后相关因素，其强表达与侵袭性肿瘤和不良后果有关，也是一种增殖标志物。本发明观察到，在crc病例和裸鼠的肿瘤中，cox4i2高表达也表现出强烈的ki-67染色信号(图2i-j)。这些结果表明，cox4i2可能与ki-67有关联。根据富集分析的结果和观察到的crc患者血清中cox4i2和fgf1(成纤维细胞生长因子1)的相关性，本发明推测成纤维细胞生长因子1可能参与了cox4i2调节的一些癌症相关行为。随后，本发明用培养液(图2k)、小鼠血清(图2l)、小鼠肿瘤(图2m)和crc组织(图2n-o)进一步验证了cox4i2与fgf1的相关性。发现在所有病例中，cox4i2的表达与fgf1的表达密切相关。
26.实施例3过表达的cox4i2促进了emt过程
27.gsea和单细胞rna-seq分析表明，cox4i2的表达与细胞上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition,emt)切相关。发现emt相关表型的增加与cox4i2过表达有关。使用整合素fgf1特异性抑制剂pd-166866治疗后，这种影响降低(图3a-b)。timer分析还发现，cox4i2表达与n-钙粘蛋白(n-cadherin，cdh2)(r＝0.320，p《0.001)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，mmp2)(r＝0.450，p《0.001)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，mmp9)(r＝0.400，p《0.001)、snai2(人蜗牛同源物2，是锌指转录因子snail超家族成员,是上皮间质转化转录因子之一)(r＝0.380，p《0.001)和snai1(人蜗牛同源物1)(r＝0.450，p《0.001)表达呈正相关，与cdh1(e-钙黏蛋白e-cadherin，cdh1)表达呈负相关(r＝0.070)这些结果通过westernblotting得到证实(图3d)。
28.实施例4 cox4i2促进血管生成和caf活化
29.为了验证血管生成和成纤维细胞活化的gsea分析和单细胞rna-seq分析，本发明建立了几种体外共培养模型。首先，发现在crc中过表达cox4i2促进了人脐静脉内皮细胞的迁移(图4a-c)，以及它们形成血管的能力(图4d-f)。fgf1抑制剂可以挽救这种恶性表型。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，cafs)来源于循环间充质干细胞(mesenchymal stem cell，mscs)，因其在形成肿瘤微环境中的特性而闻名。非接触共培养模型(图4g)显示，cox4i2过表达能促进mscs向caf分化，这主要体现在共培养系统中caf激活标记物显著增多(图4h-l)。成纤维细胞活化蛋白(fap)、成纤维细胞特异性蛋白-1(s100a4)和α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)均常用于标记活化的caf。这些观察结果还表明，用fgf1抑制剂预处理降低了共培养单元中msc向caf的分化。癌细胞的侵袭不仅仅是指肿瘤细胞本身，还包括周围基质微环境中内皮细胞和成纤维细胞的募集。迁移分析证实，cox4i2过表达增加了癌细胞对caf的募集(图4m-o)。
30.以上实验结果表明，cox4i2通过刺激血管生成和成纤维细胞活化促进crc进展。因此，cox4i2蛋白可作为直肠癌预后的预测或免疫治疗筛查的标志物，也可以作为治疗靶点。
31.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：1.一种人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物，其特征在于，它属于细胞色素c氧化酶家族gene cards gene symbol: cox4i2。2.一种人结直肠癌免疫治疗反应性的预测性生物标志物，其特征在于，它属于细胞色素c氧化酶家族gene cards gene symbol: cox4i2。3.一种人结直肠癌预后的预测或免疫治疗筛查的试剂盒，其特征在于，它包括cox4i2蛋白。4.根据权利要求2所述人结直肠癌预后的预测或免疫治疗筛查的试剂盒，其特征在于，所述的cox4i2蛋白的氨基酸序列为：met-leu-pro-arg-ala-ala-trp-ser-leu-val-leu-arg-lys-gly-gly-gly-gly-arg-arg-gly-met-his-ser-ser-glu-gly-thr-thr-arg-gly-gly-gly-lys-met-ser-pro-tyr-thr-asn-cys-tyr-ala-gln-arg-tyr-tyr-pro-met-pro-glu-glu-pro-phe-cys-thr-glu-leu-asn-ala-glu-glu-gln-ala-leu-lys-glu-lys-glu-lys-gly-ser-trp-thr-gln-leu-thr-his-ala-glu-lys-val-ala-leu-tyr-arg-leu-gln-phe-asn-glu-thr-phe-ala-glu-met-asn-arg-arg-ser-asn-glu-trp-lys-thr-val-met-gly-cys-val-phe-phe-phe-ile-gly-phe-ala-ala-leu-val-ile-trp-trp-gln-arg-val-tyr-val-phe-pro-pro-lys-pro-ile-thr-leu-thr-d-glu-arg-lys-ala-gln-gln-leu-gln-arg-met-leu-d-met-lys-val-asn-pro-val-gln-gly-leu-ala-ser-arg-trp-d-tyr-glu-lys-lys-gln-trp-lys-lys。5.cox4i2蛋白在制备人结直肠癌患者预后及免疫治疗反应性的预测性生物标志物中的应用。6.cox4i2蛋白在制备人结直肠癌预后的预测或免疫治疗筛查的试剂盒中的应用。
技术总结本发明公开了细胞色素C氧化酶亚单位4亚型2（COX4I2）在制备人结直肠癌患者预后及免疫治疗反应性的预测性生物标志物中的应用。本发明通过体外和体内评估了COX4I2水平与临床特征及其生物学作用的相关性，发现COX4I2水平升高与结直肠癌患者不良预后相关，实验研究还观察到，COX4I2可参与结直肠癌细胞的上皮-间充质转化(EMT)，促进成纤维细胞生长因子1(FGF1)的表达，激活和招募肿瘤相关成纤维细胞和促进肿瘤血管生成。因此COX4I2可作为结直肠癌患者预后的生物标志物，也可能是治疗开发的一个新靶点。靶点。靶点。
技术研发人员：邹玺 李洁玭 刘沈林 陈玉根 刘元杰 曾树宏
受保护的技术使用者：江苏省中医院
技术研发日：2022.04.30
技术公布日：2022/7/4
