一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条、其检测方法和应用
技术领域
1.本发明属于比率荧光免疫分析快速检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条、其检测方法和应用。
背景技术：2.黄曲霉毒素m1(afm1)是黄曲霉毒素b1的羟基化代谢物，通常哺乳动物由于直接摄入受黄曲霉毒素b1污染的饲料，会在奶中排泄afm1，因此afm1常常在奶类产品中检测到。一旦出现在奶中，afm1就不会受到热处理(例如巴氏杀菌)的影响。2002年，国际癌症研究机构将afm1列为一类致癌物。因此，亚洲和北美的一些国家，包括中国和美国，将牛奶中afm1的最大限量定为0.5μg/l；欧盟将奶制品中afm1的最大限量定为0.05μg/l。尽管现有的afm1的检测方法，如高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱以及酶联免疫吸附试验(elisa)都能够满足afm1的检测需求，但是这些方法都需要昂贵的仪器和专业的检测人员，这阻碍了这些技术在日常生活中的推广。
3.免疫层析技术是一种简单快速且不需要专业技能的检测技术，检测人员仅通过肉眼就可以分析结果，适用于现场分析。基于aunps的免疫层析试纸条是目前最常见的试纸条，但是其灵敏度低，无法满足实际检测需求。因此，为了提高灵敏度，近年来研究人员开发了新的方法，采用磁性纳米微球或量子点荧光微球来提高灵敏度，尽管都得到了较低的检出限，但是仍然存在以下问题：首先，afm1是小分子，检测形式仅限于竞争法，检测线(t线)颜色强度与分析物浓度成反比，竞争性测定的测定结果在t线有色被解释为阴性，t线不存在颜色时，结果为阳性。因此只有在高浓度下t线消失时才被判断为阳性，灵敏度低。当样品具有中等目标浓度水平，显示出颜色较弱的t线时，未经培训的检测人员会造成误读。其次，这些检测方法在可视化检测上，只能提供一个是/否的结果，无法给出半定量的结果。最后，采用荧光进行定量检测，需要专门的仪器，这牺牲了用户友好性，不利于现场检测。为了解决上述问题，研究人员通常通过在硝化纤维素(nc)膜上分配多条t线来实现半定量检测。这类试纸条，在不同的分析浓度范围，会显现出不同的t线条数，因此可以根据t线的数量来裸眼判断大致的浓度范围。然而多条t线的试纸制备繁琐，对探针和半抗原的用量都比单一t线的试纸用量更大，最重要的是，这类试纸条也只能区分浓度差异较大的范围，当需要窄浓度范围内的半定量信息时不适用。低灵敏度和半定量能力差仍然是目前竞争法试纸条需要解决的问题。
技术实现要素：4.本发明目的是克服现有黄曲霉毒素m1试纸条灵敏度低、缺乏半定量结果的问题，采用比率荧光技术，提供一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条、其检测方法和应用。本发明中提供一种可用于黄曲霉毒素m1检测的高灵敏、可半定量的比率荧光试纸条及检测方法，能够很好的检测牛奶中黄曲霉毒素m1含量。
5.本发明的第一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，所述比率荧光试纸条包括样品垫、反应膜(反应膜为硝酸纤维素膜)以及吸水垫，所述反应膜位于中间，样品垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端；所述样品垫经过处理后得到；所述反应膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)，反应膜的t线上同时包被黄曲霉毒素m1完全抗原和牛血清白蛋白bsa修饰的绿色荧光微球，c线上包被羊抗鼠二抗；其中，所述黄曲霉毒素m1完全抗原为牛血清白蛋白bsa偶联黄曲霉毒素m1。
6.所述样品垫经后处理后得到，即是将样品垫浸泡在含有0.5％～2％bsa的溶液中充分浸润后，将浸润后的样品垫取出并干燥，即后处理完成。
7.进一步地，本发明所述的检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条样品垫的处理方式如下：首先将样品垫浸泡在含有0.5％～2％bsa、1％～10％蔗糖、0.25％～3％吐温20和0.03％～0.3％proclin 300的浓度为0.01～0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)中，取出后在37℃下干燥，即后处理完成。
8.本发明的t线包被液中，黄曲霉毒素m1完全抗原的浓度为0.1～1mg/ml，bsa修饰的绿色荧光微球的浓度为0.2～2mg/ml。本发明的c线包被液中，羊抗鼠二抗的浓度为0.5～2mg/ml。
9.在本发明中，所述检测线t线是将0.1～1mg/ml黄曲霉毒素m1完全抗原和0.2～2mg/ml的bsa修饰的绿色荧光微球混匀后喷涂到硝酸纤维素膜的t线区域上，硝酸纤维素膜的t线区域长度方向上每厘米的喷涂量为0.5～1.5μl/cm。例如，当试纸条的宽度为0.4cm，t线区域长度即为0.4cm，喷涂量为0.2～0.6μl。
10.在本发明中，所述质控线c线是将0.5～2mg/ml的羊抗鼠二抗喷涂到硝酸纤维素膜的c线区域上，硝酸纤维素膜的c线区域长度方向上每厘米的喷涂量为0.5～1.5μl/cm。例如，当试纸条的宽度为0.4cm，c线区域长度即为0.4cm，喷涂量为0.2～0.6μl。
11.在本发明中，将喷涂好的硝酸纤维素膜置于37℃烘箱中烘干备用。
12.在本发明中，所述黄曲霉毒素m1完全抗原和bsa修饰的绿色荧光微球用0.01mol/l ph 7.4的磷酸缓冲液(pbs)稀释至终浓度为0.1～1mg/ml。所述羊抗鼠二抗用0.01mol/l ph 7.4的磷酸缓冲液稀释至终浓度0.1mg/ml-0.5mg/ml。
13.本发明所述时间比率荧光试纸条中，吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为2-4mm；所述吸水纸﹑样品垫与硝酸纤维素膜分别重叠的部分位于硝酸纤维素膜的上侧。
14.反应膜上的检测线和质控线两线之间相距4～10mm；所述试纸条的宽度为3-5mm。
15.所述绿色荧光微球为羧基修饰的绿色量子点二氧化硅复合荧光微球，所述绿色荧光微球的荧光发射峰为510～550nm，绿色荧光微球的平均粒径为100～500nm。
16.本发明的第二个目的提供一种基于比率荧光试纸条检测黄曲霉毒素m1含量的方法，所述方法包括以下步骤：
17.s1：将黄曲霉毒素m1标准品用0.1mol/lph 7.4的pbs溶液配制成一系列不同浓度的黄曲霉毒素m1标准品溶液；然后取经红色磁性荧光微球标记的黄曲霉毒素m1单克隆抗体，加入至配制的黄曲霉毒素m1标准品溶液中，混匀，15～45℃下孵育使其充分竞争反应，然后进行磁分离，弃去溶液，加入pbs缓冲液，混匀后加入到权利要求1-6任一所述的比率荧光试纸条中的样品垫上进行层析，层析结束后在365nm紫外灯下进行拍照，得到检测线的标
准照片；通过软件读取照片中检测线的rgb数值，得到r/g值；
18.s2：以r/g值为纵坐标，黄曲霉毒素m1标准品溶液的浓度为横坐标，进行标准曲线绘制，得到黄曲霉毒素m1相应的标准曲线；
19.s3：将待测样品分散于0.1mol/lph 7.4的pbs溶液中，配制得到样品溶液；将经红色磁性荧光微球标记的黄曲霉毒素m1单克隆抗体与样品溶液混匀，15～45℃下孵育使其充分竞争反应，然后进行磁分离，弃去样品溶液，加入pbs缓冲液，混匀后加入到权利要求1-5任一所述比率荧光试纸条中的样品垫上进行层析，层析结束后在365nm紫外灯下进行拍照，并与步骤s1得到的标准照片进行颜色对照，得到待测样品中黄曲霉毒素m1的浓度范围，即半定量结果；通过软件读取照片中检测线的rgb数值，得到r/g值代入步骤s2所得的标准曲线，即得到待测样品中黄曲霉毒素m1的浓度，即定量结果。
20.本发明所述红色磁性荧光微球的粒径为150～600nm，红色磁性荧光微球的荧光发射峰为600～650nm。
21.本发明所述的检测方法，步骤s1中孵育时间为10-15min，磁分离时间为5-30min。
22.本发明还提供了上述时间比率试纸条在食品检测领域的应用。
23.本发明的优点及积极效果：
24.1、本发明将比率荧光技术与免疫层析技术相结合，当分析物的浓度不同时，会产生明显的色调变化，因此，检测人员可以根据不同颜色对分析物浓度进行半定量。当分析物浓度从零到低浓度，到中浓度再到高浓度变化时时，试纸条会显示出不同的颜色，这种颜色变化使得检测人员在中低浓度时就能够裸眼检测出分析物。相比于颜色强弱的区分，这种不同颜色的区分方式对于未经训练的人员更加容易辨认，半定量更加准确。
25.2、本发明制备的试纸条采用比率荧光技术，具有自校准功能，荧光比率不受拍照参数、激发光、环境光变化等因素影响，相比于用单信号的荧光强度进行定量，定量更加准确。
26.3、本发明采用手机进行拍照读数，不需要检测仪器，更加便捷，适合现场快速检测。
附图说明
27.图1是羧基修饰的磁性荧光微球的透射电镜图。
28.图2是羧基修饰的绿色量子点二氧化硅微球的透射电镜图。
29.图3是比率荧光试纸条的示意图
30.图4是比率荧光试纸条检测黄曲霉毒素m1时在紫外灯下的标准照片。
31.图5是比率荧光试纸条检测黄曲霉毒素m1时的标准曲线。
32.图6是黄曲霉毒素m1的半定量实验结果。
33.图7是黄曲霉毒素m1的特异性实验结果。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
35.本发明中，氨水的质量浓度为25～28％。
36.空白例1：羧基修饰的磁性荧光微球的制备方法如下：
37.(1)fe3o4的合成
38.首先将0.81gfecl3·
6h2o和0.318g二水合柠檬酸钠溶解于30ml乙二醇溶液中，然后加入0.7ml水和1.8g醋酸钠继续搅拌30分钟，最后将溶液放入50ml反应釜中，在200℃下反应10h。待反应釜冷却后，将得到的沉淀分别用乙醇和水洗3遍，并保存在水中，备用。
39.(2)fe3o4@dsio2的合成
40.首先将3g ctab和0.9g尿素溶解于45ml水中，并置于机械搅拌下。然后加入100mg fe3o4和45ml含有2.2ml正戊醇和2mlteos的环己烷溶液，剧烈搅拌1h，随后整个混合溶液在70℃水浴下回流16h。反应结束后，沉淀(即fe3o4@dsio2)通过磁分离进行收集，并用乙醇洗涤3遍。然后，沉淀在80℃丙酮溶液中回流48h，以充分除去树枝状二氧化硅(即dsio2)孔道中的ctab。最后，fe3o4@dsio2通过离心收集，用乙醇洗3遍，并保存在20ml乙醇溶液中备用。
41.(3)羧基化磁性荧光微球(fsqs)合成
42.首先将0.25ml氨水和0.2ml(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)添加到步骤(2)制备的20ml含fe3o4@dsio2乙醇溶液中，以制备巯基化的fe3o4@dsio2。反应结束后，离心收集沉淀，并用乙醇洗涤3次。随后，取10mg沉淀加入1.0ml分散浓度为10mg/ml的红色荧光cdse/cds/zns qds(rqds)氯仿溶液，并超声5分钟，以获得均匀分散的溶液。通过10000rpm离心5分钟得到fe3o4@dsio2/rqds沉淀，并用氯仿洗涤一次以除去过量的rqds。
43.接着，在超声条件下，将fe3o4@dsio2/rqds沉淀分散在100μl辛基三甲氧基硅烷(otms)中，然后加入含有7.5ml甲醇和187.5μl氨水的混合液，继续超声30分钟。通过10000rpm离心收集沉淀，并用甲醇洗涤一遍以除去过量的otms，随后分散在16.5ml水和33μl氨水中，搅拌18h，以沉积二氧化硅薄层。离心后，将沉淀重新分散在20ml乙醇，5ml水和625μl氨水的混合物中，每1h时向其中注入15μl teos，总计8h注入120μl teos。8h后，通过离心收集得到fsqs，并用乙醇洗涤3次。
44.fsqs按照如下步骤对fsqs进行羧基化。先将上述fsqs沉淀重新分散在20ml乙醇，0.5ml氨水和20μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)的混合溶液中，在室温下搅拌12h，以制备氨基化的fsqs。反应结束后，将沉淀离心，用乙醇洗涤，然后再分散在10ml的含0.1mol/l丁二酸酐的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，在室温下搅拌24h。最后通过离心收集羧基化的fsqs，并用乙醇洗3遍，最后分散在超纯水中备用。
45.空白例1制备的羧基修饰的磁性荧光微球的透射电镜图如图1所示，该羧基修饰的磁性荧光微球平均粒径500nm，荧光发射峰为626nm。
46.空白例2：羧基修饰的绿色量子点二氧化硅微球合成方法如下：
47.(1)树枝状二氧化硅(dsio2)纳米微球的合成。
48.将68mg三乙醇胺添加到25ml水中，并将溶液在80℃下搅拌30分钟。接着，加入380mg ctab和168mg水杨酸钠，继续搅拌1h。然后，加入4ml teos，并在80℃下继续反应3h。通过离心收集生成的白色沉淀，并用乙醇洗涤3次，再分散在由50ml盐酸和50ml甲醇组成的混合物中，在60℃下搅拌6h以除去ctab，并重复一次。最后将得到的dsio2分散在200ml乙醇中。
49.(2)绿色量子点二氧化硅微球合成
50.将2.5ml氨水和1ml mptms添加到步骤(1)制备的含dsio2的乙醇溶液中，以制备巯基化的dsio2。在室温条件下剧烈搅拌12h后，通过离心收集巯基化的dsio2沉淀，并用乙醇洗
涤3次。随后，将0.5ml分散浓度为10mg/ml的绿色荧光cdznse/cds/zns qds(gqds)的氯仿溶液添加到5mg巯基化dsio2沉淀中，并将所得混合物超声5分钟，得到分散均匀的溶液。通过10000rpm离心5分钟得到dsio2/gqds，并用氯仿洗去过量的gqds。接着，在超声条件下，将得到的dsio2/gqds沉淀分散在100μl otms中，然后加入含有7.5ml甲醇和187.5μl氨水的混合液，继续超声30分钟。通过10000rpm离心收集沉淀，并用甲醇洗一遍以除去过量otms，随后分散在16.5ml水和33μl氨水中，搅拌18h，以沉积二氧化硅薄层。离心后，将沉淀重新分散在10ml乙醇，2.5ml水和0.312μl氨水的混合物中，每1h向其中注入7.5μl teos，通过方法继续包覆二氧化硅，总计10h注入75μl teos。10h后，通过离心收集得到gsqs沉淀，并用乙醇洗3次。
51.(3)绿色量子点二氧化硅微球的羧基修饰
52.先将步骤(2)制备的绿色量子点二氧化硅微球沉淀(gsqs沉淀)重新分散在10ml乙醇，0.25ml氨水和10μl aptes的混合溶液中，在室温下搅拌12h，以制备氨基化的gsqs。反应结束后，将沉淀离心，用乙醇洗涤，然后再分散在5ml的含0.1mol/l丁二酸酐的dmf溶液中，在室温下搅拌24h。最后通过离心收集羧基化的gsqs，并用乙醇洗3遍，最后分散在超纯水中备用。
53.空白例2制备的羧基修饰的绿色量子点二氧化硅微球的透射电镜图如图2所示，该羧基修饰的绿色量子点二氧化硅微球的平均粒径300nm，荧光发射峰为525nm。
54.实施例1：磁性荧光微球标记黄曲霉毒素m1单克隆抗体的荧光探针制备荧光探针的具体制备方法如下：
55.(1)将2mg空白例1制备的羧基修饰的磁性荧光微球(平均粒径500nm，荧光发射峰为626nm)，2mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和2mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(nhs)溶解在1ml的pb(0.01mol/l，ph＝6.0)溶液中，在25℃下，200rpm摇床上孵育30分钟。
56.(2)10000rpm离心5min，弃上清，加入1mlpb(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液，超声分散。然后加入2.5μg黄曲霉毒素m1抗体，并在25℃下，200rpm摇床上震荡2.5h。
57.(3)加入100μl的含有10％w/w bsa的封闭液，封闭2h。
58.(4)将混合物以10000rpm离心5分钟，并用pb(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液洗涤两次。最后将得到的荧光探针保存在0.5ml含有2.5％bsa，1％蔗糖和0.1％proclin300的0.02mol/lpb(ph＝7.4)溶液中。
59.实施例2：bsa修饰的绿色荧光微球的制备
60.(1)将2mg空白例2制备的羧基修饰的绿色量子点二氧化硅微球(平均粒径300nm，荧光发射峰为525nm)，2mg的edc和2mg的nhs溶解在1ml的pb(0.01mol/l，ph＝6.0)溶液中，在25℃下，200rpm摇床上孵育30分钟。
61.(2)10000rpm离心5min，弃上清，加入1mlpb(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液，超声分散，然后加入5μl的含有10％bsa的水溶液，反应2h。
62.(3)将混合物以10000rpm离心5分钟，并用pb(0.01mol/l，ph＝7.4)洗涤两次。最后将得到的bsa修饰的绿色量子点二氧化硅微球保存在0.01mol/l pbs(ph＝7.4)溶液中，bsa修饰的绿色荧光微球的分散浓度为1mg/ml。
63.实施例3：基于标记磁性荧光微球的黄曲霉毒素m1免疫试纸条的制备
64.该试纸条的制备包括以下步骤：
65.(1)将未处理的样品垫用含有1％bsa，2.5％蔗糖，1％吐温20和0.1％proclin300的0.02mol/lpb溶液(ph＝7.4)浸泡1min，浸泡后的样品垫从溶液中取出后在37℃的烘箱中干燥。
66.(2)向实施例2中制备的bsa修饰的绿色荧光微球分散液(1mg/ml)中加入黄曲霉毒素m1-bsa，使分散液中黄曲霉毒素m1-bsa的终浓度为0.5mg/ml，得到t线包被液。c线包被液为羊抗鼠二抗(1mg/ml)的pbs溶液。t线包被液和c线包被液分别以1.0μl/cm的速度喷涂在硝酸纤维素膜上作为t线和c线(t线和c线区域长度方向上每厘米的喷涂量均为1.0μl/cm)。然后将样品垫和硝酸纤维素膜在37℃下干燥过夜。
67.(3)将样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫以2mm的重叠组装到的聚苯乙烯底板上，并切成4mm宽的条，保存在干燥器中。结构图如图3所示底板上从左到右依次为样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫。
68.实施例4：黄曲霉毒素m1比率荧光试纸条标准照片和标准曲线的绘制
69.将黄曲霉毒素m1标准品用0.1mol/lph 7.4的pbs溶液配制成黄曲霉毒素m1浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4ng/ml的标准溶液用于比率荧光检测。然后将5μg实施例1制备的荧光探针加到1ml标准溶液中，孵育10min，接着磁分离25min。随后弃去上清，沉淀加入100μl浓度为10mmol/l的pbs溶液，重新分散均匀得到样液。进行检测时，取80μl样液滴加到样品垫上。6分钟后，用huawei p30智能手机在365nm激发光下进行拍照。相机主要参数设置为(1)曝光时间：0.25s；(2)iso感光度：iso-200；(3)色温：5000k。每个样品进行三次重复测定。在定量时，使用手机应用程序color picker读取t线上的rgb数值。比率荧光试纸条检测不同浓度的黄曲霉毒素m1时在紫外灯下的标准照片如图4所示。以r/g值为纵坐标，黄曲霉毒素m1浓度为横坐标，进行标准曲线绘制，得到的标准曲线如图5所示。
70.实施例5：黄曲霉毒素m1比率荧光试纸条的性能测试
71.1.半定量检测：
72.为了检验颜色半定量读取的实用性和可靠性，我们通过14名独立用户进行了裸眼结果读出实验。具体而言，我们首先将标准照片提供给用户，用于裸眼读取结果。随后按照实施例4中的检测方法，将黄曲霉毒素m1配制在0.1mol/lph 7.4的pbs溶液中形成不同黄曲霉毒素m1加入浓度的样液。用户对3批次4个不同黄曲霉毒素m1浓度的样液使用比率荧光试纸条进行了检测，并与图4中的标准照片进行对照分析，每个浓度总共进行了3
×
14＝42次读数。用户的所有读数结果如图6所示，由于不同浓度的颜色差异明显，特定浓度的读数准确度为90.5～100％，这表明比率荧光试纸能够像读取ph试纸一样简单、可重复且可靠地现场检测黄曲霉毒素m1，仅需通过荧光颜色就可以判断样品浓度。
73.2.精密度和准确度测试
74.样品处理：将60μl三氯乙酸溶液(50％)加入到2ml牛奶样品中，充分振荡1min以沉淀蛋白质。接着用氢氧化钠溶液调节ph到7，并用100mmol/l的ph＝7的pbs溶液定容至10ml。然后进行离心(8000rpm，5min)，上清液经过0.22μm的滤头进行过滤后得到待测样液，即是阴性牛奶样本。
75.检测：为了验证黄曲霉毒素m1试纸条的精密度与准确性，对阴性牛奶样品进行加标回收试验，每种样本的添加浓度均设置高、中、低三组不同的加标浓度，每组浓度梯度均
设置三组平行试验。以加标回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果的变异系数作为精密度评价指标。
76.如表1所示，采用比率荧光试纸条分别检测了三个不同黄曲霉毒素m1加标浓度的样本(阴性牛奶样本中黄曲霉毒素m1加标浓度分别为0.02ng/ml、0.05ng/ml和0.5ng/ml)，三个不同黄曲霉毒素m1浓度的样品的回收率分别为102.97％、91.18％和71.24％，变异系数分别为14.9％、10.5％和12.5％。这些结果表明，该检测方法用于黄曲霉毒素m1的定量检测在浓度较低时具有良好的准确性和重现性，以及良好的定量能力。
77.表1黄曲霉毒素m1比率荧光试纸条的精密度和准确度检测结果
[0078][0079]
3.特异性测试
[0080]
选取与黄曲霉毒素m1具有类似结构或者类似功能的类似物(afm2、afg1、afg2、afb1和afb2)进行评价比率荧光试纸条的特异性。通过用本发明提供的试纸条检测阴性牛奶样本(记为control)和各个毒素(即afm1、afm2、afg1、afg2、afb1和afb2)在阴性牛奶样本中的加标阳性样本(2ng/ml)，分别记录其t线的r/g值，结果见图7中。由图7可以看出，黄曲霉毒素m1与其结构类似物没有交叉反应，表明该试纸条性具有较好的特异性。
[0081]
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
技术特征：1.一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，包括样品垫、反应膜以及吸水垫，反应膜位于中间，样品垫与吸水垫分别搭接于反应膜的左右两端，反应膜上设有检测线t线和质控线c线，其特征在于所述样品垫经后处理后得到，即是将样品垫浸泡在含有0.5%~2% bsa的溶液中充分浸润后，将浸润后的样品垫取出并干燥，即后处理完成；所述反应膜的t线上同时包被黄曲霉毒素m1完全抗原和牛血清白蛋白bsa修饰的绿色荧光微球，c线上包被羊抗鼠二抗；其中，所述黄曲霉毒素m1完全抗原为牛血清白蛋白bsa偶联黄曲霉毒素m1。2.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，其特征在于所述反应膜为硝酸纤维素膜，t线包被液为0.1~1mg/ml黄曲霉毒素m1完全抗原和0.2~2mg/ml的bsa修饰的绿色荧光微球；所述检测线t线的制备过程是将t线包被液混匀后喷涂到硝酸纤维素膜的t线区域上，硝酸纤维素膜的t线区域长度方向上每厘米的喷涂量为0.5~1.5μl/cm，随后干燥；c线包被液为0.5~2 mg/ml的羊抗鼠二抗；所述质控线c线的制备过程是将c线包被液喷涂到硝酸纤维素膜的c线区域上，硝酸纤维素膜的c线区域长度方向上每厘米的喷涂量为0.5~1.5μl/cm，随后干燥。3.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，其特征在于反应膜上的检测线和质控线两线之间相距4~10 mm；所述试纸条的宽度为3-5mm。4.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，其特征在于所述绿色荧光微球为羧基修饰的绿色量子点二氧化硅复合荧光微球，所述绿色荧光微球的荧光发射峰为510~550 nm，绿色荧光微球的平均粒径为100~500 nm。5.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，其特征在于样品垫经后处理的具体步骤为：首先将样品垫浸泡在含有0.5%~2% bsa、1%~10%蔗糖、0.25%~3%吐温20和0.03%~0.3% proclin 300的浓度为0.01~0.1 mol/l的磷酸盐缓冲溶液（ph = 7.4）中，取出后在37℃下干燥，即后处理完成。6.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条，其特征在于所述牛血清白蛋白bsa修饰的绿色荧光微球的制备方法包括以下步骤：1）绿色荧光微球为羧基修饰的绿色量子点二氧化硅复合荧光微球，将绿色荧光微球、edc和nhs按照1 : 0.5~2 : 0.5~2的质量比分散于pb缓冲液中，在25℃下，100~300rpm摇床上孵育20~40分钟，以活化绿色量子点二氧化硅微球表面羧基；2）将活化的微球离心弃去上清并分散于pb缓冲液中，然后加入含有bsa的水溶液，室温反应1~3h；其中，步骤2）中bsa与步骤1）中绿色荧光微球质量之比为0.2~0.3:1；3）将反应后的微球离心弃去上清，并用pb缓冲液洗涤，即得bsa修饰的绿色量子点二氧化硅微球。7.一种基于比率荧光试纸条检测黄曲霉毒素m1含量的方法，其特征在于包括以下步骤：s1：将黄曲霉毒素m1标准品用pbs缓冲液配制成一系列不同浓度的黄曲霉毒素m1标准品溶液；然后取经红色磁性荧光微球标记的黄曲霉毒素m1单克隆抗体，加入至配制的黄曲霉毒素m1标准品溶液中，混匀，15~45℃下孵育使其充分竞争反应，然后进行磁分离，弃去溶液，加入pbs缓冲液，混匀后加入到权利要求1-6任一所述的比率荧光试纸条中的样品垫上进行层析，层析结束后在365 nm紫外灯下进行拍照，得到检测线的标准照片；通过软件读取
照片中检测线的rgb数值，得到r/g值；s2：以r/g值为纵坐标，黄曲霉毒素m1标准品溶液的浓度为横坐标，进行标准曲线绘制，得到黄曲霉毒素m1相应的标准曲线；s3：将待测样品分散于pbs缓冲液中，配制得到样品溶液；将经红色磁性荧光微球标记的黄曲霉毒素m1单克隆抗体与样品溶液混匀，15~45℃下孵育使其充分竞争反应，然后进行磁分离，弃去样品溶液，加入pbs缓冲液，混匀后加入到权利要求1-6任一所述比率荧光试纸条中的样品垫上进行层析，层析结束后在365 nm紫外灯下进行拍照，并与步骤s1得到的标准照片进行颜色对照，得到待测样品中黄曲霉毒素m1的浓度范围，即半定量结果；通过软件读取照片中检测线的rgb数值，得到r/g值代入步骤s2所得的标准曲线，即得到待测样品中黄曲霉毒素m1的浓度，即定量结果。8.如权利要求7所述的一种基于比率荧光试纸条检测黄曲霉毒素m1含量的方法，其特征在于所述经红色磁性荧光微球标记的黄曲霉毒素m1单克隆抗体的制备方法为：m1：将羧基修饰的红色磁性荧光微球、edc和nhs按照1 : 0.5~2 : 0.5~2的质量比分散于pb缓冲液中，在25℃下，100~300rpm摇床上孵育20~40分钟，以活化磁性荧光微球表面羧基；m2：将活化的微球离心弃去上清并分散于pb缓冲液中，然后加入黄曲霉毒素m1抗体，在25℃下，100~300rpm摇床上震荡2~3h；其中，步骤m2中黄曲霉毒素m1抗体与步骤m1中羧基修饰的红色磁性荧光微球质量之比为0.001~0.003:1；m3：加入含有bsa的封闭液，封闭1.5~2.5 h；m4：将封闭后的微球离心弃去上清，并用pb缓冲液洗涤，即得经红色磁性荧光微球标记的黄曲霉毒素m1单克隆抗体。9.如权利要求7所述的一种基于比率荧光试纸条检测黄曲霉毒素m1含量的方法，其特征在于，所述红色磁性荧光微球的粒径为150~600 nm，红色磁性荧光微球的荧光发射峰为600~650 nm；步骤s1中孵育时间为10-15min，磁分离时间为5-30min。10.如权利要求1-6任一所述的比率荧光试纸条在食品检测领域的应用。
技术总结本发明公开了一种检测黄曲霉毒素M1的比率荧光试纸条、其检测方法和应用，比率荧光试纸条包括样品垫、反应膜以及吸水垫，反应膜位于中间，样品垫与吸水垫分别搭接于反应膜的左右两端，反应膜上设有检测线T线和质控线C线。反应膜的T线上同时包被黄曲霉毒素M1完全抗原和牛血清白蛋白BSA修饰的绿色荧光微球，C线上包被羊抗鼠二抗；其中，黄曲霉毒素M1完全抗原为牛血清白蛋白BSA偶联黄曲霉毒素M1。本发明中提供一种可用于黄曲霉毒素M1检测的高灵敏、可半定量的比率荧光试纸条及检测方法，能够很好的检测牛奶中黄曲霉毒素M1含量，检测方法中将比率荧光技术与免疫层析技术相结合，可以根据不同颜色对分析物浓度进行很好的半定量，检测方法方便快捷。测方法方便快捷。测方法方便快捷。
技术研发人员：汪晶 蒋晨星 黄梅 黄亮
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/7/4
