1.本发明属于提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒技术领域，具体涉及一种基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法。
背景技术：2.真核细胞释放到细胞外空间的小泡称为胞外囊泡(extracellular vesicles，ev)。到目前为止，已经在真核细胞中发现了3种ev，包括微泡、外泌体、凋亡小体。而外泌体是多泡体(mvb)与细胞质膜融合，释放ilvs到胞外空间，直径约在40-200nm的细胞囊泡，广泛分布于动物的体液中。而在蓝莓及类似浆果体内同样存在类似外泌体的囊泡，被称为蓝莓外泌体样纳米颗粒(blueberry-exosome-like nanoparticles，elns)。
3.近年来，外泌体逐渐成为医疗美容、可食性天然产品的研究热点，各项外泌体研究均致力于寻找更好的治疗策略以解决肿瘤、糖尿病、癌症等疾病，取得了可观效果。而蓝莓及类似浆果中含有丰富的营养成分，对治疗调节肠胃、降血糖、防癌抗癌有一定的作用，所以b-elns的研究还是具有广阔的前景的。
4.现阶段，相对于动物中的外泌体，植物来源的elns的相关研究还处于初始阶段，缺乏高效便捷的提取方法。b-elns的提取方法主要采用超速离心法，该方法先用低速离心逐步去除果胶、细胞和碎片等物质，再通过超速离心使外泌体沉淀，重悬于缓冲液中，但该方法过程繁琐、耗时费力，依赖实验仪器和操作人员的经验，得到的b-elns易与微泡碎片及可溶性蛋白共混。显然，延用传统超速离心法虽在一定条件下能够满足b-elns的提取，但亟待一种新型技术的出现来解决外泌体纯度较低、依赖仪器等问题。
技术实现要素：5.本发明旨在解决背景技术中记载的问题，提供一种基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，步骤1，将浆果与pbs按1:5稀释后榨汁，得到稀释的浆果汁；稀释后的浆果汁在4℃下经过三个连续的离心处理；
7.步骤2，超滤浓缩：将离心处理后的稀释样液，在4℃下5000
×
g离心浓缩20min，使用过的超滤管用0.1m naoh浸泡1h，用蒸馏水清洗，用pbs浸泡保存，得浓缩样液；
8.步骤3，使用qev
10
分离柱处理浓缩样液，并进行浆果外泌体样液收集；
9.步骤4，将qev
10
分离柱收集的浆果外泌体样液在真空抽滤泵的作用下通过0.22um膜，在4℃下5000
×
g离心浓缩20min，收集浓缩的浆果外泌体样纳米颗粒；
10.步骤5，粒径测量：采用纳米粒子颗粒跟踪分析仪对浆果外泌体样纳米颗粒的粒径进行分析。
11.在本发明的一种优选实施方式，步骤7中，采用tem电镜分析，分析方式如下，用戊
二醛将蓝莓外泌体样液固定，将5-10μl外泌体溶液滴加到铜网上,室温吸10min左右,用滤纸吸去多余的液体，然后向铜网上滴加10ul 2％的磷钨酸溶液,在室温下对外泌体染色处理,用滤纸吸去多余的染色液,将铜网在室温下晾干。
12.在本发明的一种优选实施方式，步骤7中，将铜网在室温下晾干后，观察外泌体粒径大小和形状。
13.在本发明的一种优选实施方式，步骤7中，磷钨酸溶的ph＝6.5。
14.在本发明的一种优选实施方式，步骤1中，三个连续的离心处理为：3000
×
g离心30min，8000
×
g离心60min和10000
×
g离心60min。
15.在本发明的一种优选实施方式，步骤3中，qev
10
分离柱前处理：将qev10分离柱组装放置于垂直支架台上，向储液罐中添加pbs缓冲液，在分离柱垂直下侧放置50ml离心管，移除分离柱底部的滑动盖，使柱子内的液体流出至50ml离心管中，当储液罐液面到达低部筛板时，表示冲洗完成，盖上底部滑动盖。
16.在本发明的一种优选实施方式，步骤3中，移除底部滑动盖，用移液枪吸取浓缩样液沿壁加入分离柱中，不可触碰储液罐底部筛板，使用收集管收集出液，此时流出液是空隙体积，当储液罐液面到达底部筛板时，添加pbs继续洗脱分离柱，当流出液到达20ml时，盖上滑动盖，继续添加pbs,在分离柱垂直下侧放置50ml离心管，移除滑动盖，开始收集外泌体样液，期间不断加入pbs。
17.在本发明的一种优选实施方式，步骤3中，冲qev
10
洗分离柱：添加140mlpbs和5ml的0.5m naoh溶液冲洗色谱柱，直至qev
10
分离柱整体呈现无色。
18.本发明的原理以及有益效果：本专利提供一种基于尺寸排阻法原理提取蓝莓及类似浆果外泌体的方法，该方法是利用b-elns在尺寸上与其他组分存在差异进行分离，依靠流动相的推动力，使组分流经色谱柱，从而到达分离的效果。尺寸排阻法操作简单，只需按要求收集相应组分的溶液，无需特殊技巧，重复性好，而且其流动相温和，不会对b-elns产生损伤，得到的b-elns更为结构完整。
19.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
20.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
21.图1为纳米颗粒追踪分析结果显示了尺寸排阻法提取的b-elns的尺寸分布；
22.图2为纳米颗粒追踪分析结果显示了超速离心法提取的b-elns的尺寸分布；
23.图3为尺寸排阻法提取的b-elns的透射电镜图像；
24.图4为超速离心法提取的b-elns的透射电镜图像。
具体实施方式
25.下面详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
26.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“竖向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
27.在本发明的描述中，除非另有规定和限定，需要说明的是，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
28.本技术提供一种基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，本实施例中，浆果以蓝莓为例，包括如下步骤：
29.步骤1，蓝莓与pbs按1:5稀释后榨汁，得到稀释的蓝莓汁，稀释后的蓝莓汁在4℃下经过三个连续的离心处理阶段，三个连续的离心处理阶段为：3000
×
g离心30min，8000
×
g离心60min、10000
×
g离心60min，本步骤，逐步去除完整的细胞、死细胞、细胞碎片及大直径囊泡等“大型”杂质。
30.步骤2，超滤浓缩：将粗离心后的稀释样液，在4℃下5000
×
g离心浓缩20min，使用过的超滤管用0.1m naoh浸泡1h，用蒸馏水清洗，用pbs浸泡保存，得到浓缩样液。
31.步骤3，预先对qev
10
分离柱进行前处理：将qev
10
分离柱组装放置于垂直支架台上，向储液罐中添加pbs缓冲液，在qev
10
分离柱垂直下侧放置50ml离心管，移除qev
10
分离柱底部的滑动盖，使qev
10
的液体流出至50ml离心管中，当储液罐液面到达低部筛板时，表示冲洗完成，盖上底部滑动盖。
32.b-elns样液收集：小心移除底部滑动盖，用移液枪吸取浓缩样液沿壁加入分离柱中，不可触碰储液罐底部筛板，使用收集管开始收集出液，此时流出液是空隙体积，当储液罐液面到达底部筛板时，添加pbs继续洗脱分离柱，当流出液到达20ml时，盖上滑动盖，继续添加pbs,在qev
10
分离柱垂直下侧放置50ml离心管，移除滑动盖，开始收集外泌体样液，期间不断加入pbs，然后，冲洗qev
10
分离柱：添加140mlpbs和5ml的0.5m naoh溶液冲洗色谱柱，当qev
10
分离柱整体呈现无色时，表明冲洗完成。
33.步骤4，将qev
10
分离柱收集的蓝莓外泌体样液在真空抽滤泵的作用下通过0.22um膜，在4℃下5000
×
g离心浓缩20min，收集浓缩的蓝莓外泌体样纳米颗粒。
34.步骤5，测量粒径:采用纳米粒子颗粒跟踪分析仪(nta)对b-elns的粒径进行分析，使用tem电镜分析：用戊二醛将蓝莓外泌体样液固定，将5-10μl外泌体溶液滴加到铜网上,室温放置10min左右,用滤纸小心吸去多余的液体。然后向铜网上滴加10ul 2％的磷钨酸溶液(ph＝6.5),在室温下对外泌体染色处理,小心用滤纸吸去多余的染色液,将铜网在室温下晾干。观察外泌体粒径大小、形状。
35.采用上述方法进行实验,并与现有技术的超速离心法进行比较，可获得如下表：
36.表1
[0037][0038]
根据表1的内容，再结合：图1纳米颗粒追踪分析结果显示了尺寸排阻法提取的b-elns的尺寸分布；图2纳米颗粒追踪分析结果显示了超速离心法提取的b-elns的尺寸分布；图3尺寸排阻法提取的b-elns的透射电镜图像；图4超速离心法提取的b-elns的透射电镜图像，可得如下结论，
[0039]
实验结果表明：两种方法制备的b-elns均为纳米级，超速离心法提取的b-elns的粒径为190.1
±
35.2nm，尺寸排阻法提取的b-elns的粒径为91.28
±
14.42nm。从粒径和电镜图中可以看到超离得到的外泌体发生聚集现象，使得测量粒径会偏大，影响外泌体的物理性质和下游分析，而尺寸排阻法提取的外泌体背景清晰，无明显的聚集现象，大小分子完全分离，使得b-elns大小更均匀，结构形态更为完整，保证了b-elns的生物活性。
[0040]
在本说明书的描述中，参考术语“优选的实施方式”、“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0041]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
技术特征：1.一种基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将浆果与pbs按1:5稀释后榨汁，得到稀释的浆果汁；稀释后的浆果汁在4℃下经过三个连续的离心处理；步骤2，超滤浓缩：将离心处理后的稀释样液，在4℃下5000
×
g离心浓缩20min，使用过的超滤管用0.1m naoh浸泡1h，用蒸馏水清洗，用pbs浸泡保存，得浓缩样液；步骤3，使用qev
10
分离柱处理浓缩样液，并进行浆果外泌体样液收集；步骤4，将qev
10
分离柱收集的浆果外泌体样液在真空抽滤泵的作用下通过0.22um膜，在4℃下5000
×
g离心浓缩20min，收集浓缩的浆果外泌体样纳米颗粒；步骤5，粒径测量：采用纳米粒子颗粒跟踪分析仪对浆果外泌体样纳米颗粒的粒径进行分析。2.如权利要求1所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤7中，采用tem电镜分析，分析方式如下，用戊二醛将蓝莓外泌体样液固定，将5-10μl外泌体溶液滴加到铜网上,室温放置10min左右,用滤纸吸去多余的液体，然后向铜网上滴加10ul 2％的磷钨酸溶液,在室温下对外泌体染色处理,用滤纸吸去多余的染色液,将铜网在室温下晾干。3.如权利要求2所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤7中，将铜网在室温下晾干后，观察外泌体粒径大小和形状。4.如权利要求3所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤7中，磷钨酸溶的ph＝6.5。5.如权利要求4所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤1中，三个连续的离心处理为：3000
×
g离心30min，8000
×
g离心60min和10000
×
g离心60min。6.如权利要求5所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤3中，qev
10
分离柱前处理：将qev10分离柱组装放置于垂直支架台上，向储液罐中添加pbs缓冲液，在分离柱垂直下侧放置50ml离心管，移除分离柱底部的滑动盖，使柱子内的液体流出至50ml离心管中，当储液罐液面到达低部筛板时，表示冲洗完成，盖上底部滑动盖。7.如权利要求6所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤3中，移除底部滑动盖，用移液枪吸取浓缩样液沿壁加入分离柱中，不可触碰储液罐底部筛板，使用收集管收集出液，此时流出液是空隙体积，当储液罐液面到达底部筛板时，添加pbs继续洗脱分离柱，当流出液到达20ml时，盖上滑动盖，继续添加pbs,在分离柱垂直下侧放置50ml离心管，移除滑动盖，开始收集外泌体样液，期间不断加入pbs。8.如权利要求7所述的基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤3中，冲qev
10
洗分离柱：添加140mlpbs和5ml的0.5m naoh溶液冲洗色谱柱，直至qev
10
分离柱整体呈现无色。
技术总结本发明属于提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒技术领域，提出了一种基于尺寸排阻法提取蓝莓及类似浆果外泌体样纳米颗粒的方法，包括步骤1，将浆果与PBS按1:5稀释后榨汁，得到稀释的浆果汁；稀释后的浆果汁在4℃下经过三个连续的离心处理；步骤2，超滤浓缩，步骤3，使用qEV
技术研发人员：袁方 冷扬帆 朱航鑫 徐晓云 潘思轶
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/4
