一种鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记引物对及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记引物对及其应用。
背景技术：2.在我国生猪养殖的模式中，经产母猪主要是长白公猪和大白母猪杂交形成的长大二元母猪，用于育肥的商品猪主要是长大二元母猪和杜洛克公猪杂交形成的杜长大三元商品猪，长大二元母猪相较于杜长大三元商品猪，具有更高的种用价值和经济价值。由于杜长大三元猪和长大二元猪在外形上相似，因此，在生猪交易过程中，经常出现将杜长大三元猪作为种猪进行自群繁育或出售的情况，这种利用低价值产品替代高价值产品的现象，在短时间内是弥补种猪资源不足的应急行为，但如果长期如此操作，不仅扰乱了市场秩序，还会打乱生猪企业的正常生产节奏，导致生猪企业种源质量倒退，从而造成巨大的经济损失。此外，生猪企业也会因内部人员公猪采精和母猪配种操作疏忽，导致出现误配产生杜长大三元种猪作为生产母猪的情况发生，从而打乱生产节奏和种猪质量，造成重大的经济损失。综上，对于杜长大三元猪和长大二元猪进行高效鉴别，具备重要的生产价值和经济价值。
3.目前，市场上没有简易、高效地鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的方法，虽然在我国生猪生产中，已实施了肉类产品的可追溯管理和应用体系，但是由于主要是以动物佩戴电子耳标和条码技术进行溯源和管理，一方面电子耳标易脱落，造成信息的缺失，另一方面，仅依靠条码技术，难以保证产品信息的真实性。在实际生产中，一般通过技术人员根据体型外貌进行杜长大三元猪和长大二元猪鉴别，但是准确性相对较差。此外，还可以对猪只个体进行基因组测序，通过聚类分析等判定猪只身份，但是需要消耗较大的经济成本、时间成本和人力成本。因此，要开发一种简单的方法对市场上的杜长大三元猪和长大二元猪进行高效鉴别迫在眉睫。
4.杜长大三元猪是长大二元猪作为母本，与杜洛克公猪杂交产生的后代，其具备50％杜洛克猪的血统。因此，基于杜洛克猪特异性表型出发，例如其特有的红棕色毛色表型，找出杜洛克猪特异性的突变位点，即相关突变位点基因型在杜洛克猪群体中固定，且完全不同于长白猪和大白猪等群体的基因型，因此，相关位点在长大二元猪群体中，仍然保持和长白猪和大白猪一致的基因型，但是由于导入50％杜洛克突变纯合基因型，在杜长大三元猪群体中，会形成两种等位基因的杂合子，相关突变位点就可以简易、高效地鉴别出杜长大三元猪和长大二元猪。
5.有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：6.本发明的目的在于针对目前杜长大三元猪和长大二元猪鉴定耗时费力，准确性不高，提供一个杜长大三元猪品种特异性的snp标记并将其开发为分子标记。
7.本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物对和检测方法。
8.本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。
9.一种开发鉴别杜长大三元猪和长大二元猪相关的分子标记的方法，以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以杜长大三元猪或长大二元猪基因组 dna为模板进行pcr扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体 181697bp处rs45435032核苷酸位点转化为分子标记。
10.所述的引物对序列为上游引物：seq id no：2，下游引物：seq id no：3。
11.按照上述的方法得到的分子标记。
12.所述的分子标记序列优选如seq id no：1所示，所述的国际猪基因组11.1 版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点在seq id no： 1中位于第381位，存在t/c多态性。
13.一种用于高效鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记的引物对，上游引物为：seq id no：2，下游引物为：seq id no：3；所述的用于高效鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记位于猪6号染色体上mc1r基因的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体 181697bp处rs45435032核苷酸位点的分子标记，且具有t/c多态性，所述snp 可以简易、高效地鉴别杜长大三元猪和长大二元猪，其中杜长大三元猪为tc基因型，长大二元猪为cc基因型。
14.一种用于高效鉴别杜长大三元猪和长大二元猪相关的snp标记的方法，包含pcr扩增杜长大三元猪或长大二元猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的t/c多态性。
15.具体判读方法，根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
16.(1)取杜长大三元猪或长大二元猪组织样品提取总dna；
17.(2)用已提取的猪基因组dna为模板，使用本发明所述的引物对进行pcr 扩增；
18.(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seq id no：1第381位的 t/c多态性。
19.本发明所述的分子标记、所述的引物对在高效鉴别杜长大三元猪和长大二元猪相关工作中的应用。
20.一种针对杜长大三元猪和长大二元猪的高效鉴别方法，包括检测杜长大三元猪或长大二元猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处 rs45435032核苷酸位点的基因型，其中tc基因型为杜长大三元猪，cc基因型为长大二元猪。
21.有益效果：
22.本发明提供的snp标记可以简易、高效地鉴别出杜长大三元猪和长大二元猪，其中杜长大三元猪为tc基因型，长大二元猪为cc基因型。基于该snp开发的分子标记及引物可用于snp的检测。因此，可以通过本snp标记高效鉴别杜长大三元猪和长大二元猪，从而帮助购买长大二元猪企业买到真正的长大二元猪，有效避免引种企业的经济损失。而对于种猪生产企业，通过鉴别杜长大三元猪和长大二元猪，将杜长大三元猪及时淘汰，有利于提高企业的生产成绩与经济效益。
附图说明
23.图1为猪6号染色体mc1r基因rs45435032位点扩增胶图
24.图2为大白猪、长白猪、杜洛克、杜长大三元猪和长大二元猪6号染色体mc1r 基因rs45435032位点分型图示例
具体实施方式
25.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
26.实施例1：
27.1试验动物来源
28.广西省某公司提供的具有准确身份信息的16头杜长大三元猪和46头长大二元猪。
29.2提取猪只个体基因组dna
30.采集16头杜长大三元猪组织样1份/头，采集46头长大二元猪组织样1份/ 头，用于个体dna提取；
31.参考天根生物科技公司组织dna提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：
32.(1)先在缓冲液gd和漂洗液pw中分别加入68ml和200ml无水乙醇，充分混匀。
33.(2)采集组织样约100mg置于2ml ep管内，完全剪碎后加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮。
34.(3)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
35.(4)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
36.(5)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
37.(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
38.(7)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中
39.(8)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
40.(9)重复操作步骤(8)。
41.(10)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
42.(11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min， 12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。
43.经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50 ng/μl于-20℃下保存备用。
44.3目的片段pcr扩增、测序与判型
45.用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：取dna模板1μl、seq id no：2和seq id no：3所示的引物各0.4μl、pcr mix试剂 10μl、双蒸水7.2μl；设置pcr扩增体系：
[0046][0047]
pcr产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约773bp，电泳图见图1，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank 中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读rs45435032位点的基因型。
[0048]
4结果
[0049]
表1给出了seq id no：1第381位点t/c(即rs45435032变异位点t/c) 在杜长大三元猪和长大二元猪鉴别工作中的效应。由表1可知，16头杜长大三元猪的基因型均为tc基因型，46头长大二元猪的基因型均为cc基因型，检测结果符合预期，检测准确性达到100％。由此可见，在针对杜长大三元猪和长大二元猪的鉴别工作中，rs45435032位点检测为tc基因型的猪只个体，即为杜长大三元猪；rs45435032位点检测为cc基因型的猪只个体，即为长大二元猪，达到简易、高效地鉴别出杜长大三元猪和长大二元猪的目的。
[0050]
表1广西省某公司杜长大三元猪和长大二元猪鉴定结果
[0051][0052][0053]
实施例2：
[0054]
1试验动物来源
[0055]
江苏省连云港市某公司提供的具有准确身份信息的29头长大二元猪。
[0056]
2提取猪只个体基因组dna
[0057]
参考实施例1中的方法提取29头长大二元猪基因组dna。
[0058]
3目的片段pcr扩增、测序与判定
[0059]
参考实施例1中的方法对目的片段进行扩增、测序与判定，判定seq id no： 1第381位点(即rs45435032变异位点)基因型。
[0060]
4结果
[0061]
表2给出了seq id no：1第381位点(即rs45435032变异位点)t/c在长大二元猪鉴别工作中的效应。由表2可知，29头长大二元猪的基因型均为cc 基因型，检测结果符合预期，检测准确性达到100％。综上所述，rs45435032变异位点用于高效鉴别杜长大三元猪和长大二元猪，准确性高，同时操作简便，成本低，适于推广使用。
[0062]
表2江苏省连云港市某公司长大二元猪鉴定结果
[0063][0064]
技术特征：1.一种开发鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的分子标记的方法，其特征在于以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以杜长大三元猪或长大二元猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点转化为分子标记。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的引物对序列为上游引物：seq id no：2，下游引物：seq id no：3。3.按照权利要求1或2所述的方法得到的分子标记。4.根据权利要求3所述分子标记，其特征在于所述的分子标记序列如seq id no：1所示，所述的国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点在seq id no：1中位于第381位，存在t/c多态性。5.一种鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记引物对，其特征在于上游引物为：seq id no：2，下游引物为：seq id no：3。6.一种检测权利要求5中所述的与鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记的鉴定方法，其特征在于包含pcr扩增杜长大三元猪或长大二元猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的t/c多态性。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取杜长大三元猪或长大二元猪组织样品提取总dna；(2)用已提取的猪基因组dna为模板，使用权利要求5所述的引物对进行pcr扩增；(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seq id no：1第381位的t/c多态性。8.权利要求3或4所述的分子标记、权利要求5所述的引物对在鉴别杜长大三元猪和长大二元猪工作中的应用。9.一种鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的鉴定方法，其特征在于包括检测杜长大三元猪或长大二元猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处rs45435032核苷酸位点的基因型，通过基因型判定确定猪只归属于杜长大三元猪或者长大二元猪，其中杜长大三元猪为tc基因型，长大二元猪为cc基因型。
技术总结本发明涉及一种鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的SNP标记引物对及其应用。所述SNP标记位于猪6号染色体上的MC1R基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体181697bp处含rs45435032核苷酸位点的分子标记，且具有T/C多态性，所述SNP标记在杜长大三元猪和长大二元猪群体间有差异基因型，其中杜长大三元猪为TC基因型，长大二元猪为CC基因型。一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。通过鉴定该SNP标记基因型来简易、高效地鉴别杜长大三元猪和长大二元猪。长大二元猪。长大二元猪。
技术研发人员：黄瑞华 刘晨曦 李平华 侯黎明 周五朵 周天威 陶伟 许会英 刘锴月
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2021.12.24
技术公布日：2022/7/4
