1.本发明涉及药物提取领域，更具体地，涉及一种分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法。
背景技术：2.低共熔溶剂是近年来发展的一类新型绿色溶剂，它们通常是由氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等)和氢键受体(如季铵盐等)按一定的化学计量比混合形成，组分通过互相作用的氢键缔合。低共熔溶剂具有离子液体的特性，也被称为“类离子液体”，绝大部分低共熔溶剂具有价格低廉、可生物降解性、低毒性、易制备等特性，被认为是传统易挥发有机溶剂的替代品。
3.京尼平苷酸(gpa)和桃叶珊瑚苷(au)是杜仲雄花中最主要的两种成分。据药理学研究表明，京尼平苷酸具有抗炎症、抗心血管病、抗神经退行性变等多种生物活性，桃叶珊瑚苷具有抗炎、软骨保护、抗氧化和抗凋亡等多种生物活性。
4.京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷结构性质相似，传统的溶剂萃取、沉淀分离、微波萃取等技术，在从杜仲雄花中萃取分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的时候存在不足，如富集倍数低、萃取效率差、有机溶剂用量大、效率低、步骤繁多等。另外，由于京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷结构性质相似，很难通过液液萃取的方式实现分离。
技术实现要素：5.基于现有技术中存在的上述技术问题，本发明建立基于低共熔溶剂的新型绿色分离双相体系，实现对京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的选择性高效分离。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
7.一种分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，包括以下步骤：
8.将杜仲雄花粗提液与萃取剂混合，萃取，得到富含京尼平苷酸的第一相溶液和富含桃叶珊瑚苷的第二相；所述萃取剂由第一溶剂和第二溶剂组成，所述第一溶剂为氯化胆碱-甘油、氯化胆碱-丙二酸、氯化胆碱-乙二酸、氯化胆碱-dl-苹果酸中的一种；所述第二溶剂为四丁基氯化磷-丙酸、甲基三辛基氯化铵-己酸、三正辛基氧膦-丙酸、四丁基氯化铵-己酸中的一种。
9.在一些实施方式中，所述第一溶剂和所述第二溶剂的体积比为1～3：0.5～2.5。
10.在一些实施方式中，提取温度为5～45℃。
11.在一些实施方式中，杜仲雄花粗提液的ph值为2.53～7.46。
12.在一些实施方式中，所述第一溶剂的含水量为5wt％～25wt％。
13.在一些实施方式中，所述粗提液的浓度为0.5～8mg/ml。
14.在一些实施方式中，所述杜仲雄花粗提液通过以下方法制得：
15.将杜仲雄花磨成粉末，过筛，然后用磷酸盐缓冲液进行提取，过滤，得到杜仲雄花粗提液。
16.在一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的ph为2.0～4.0；优选为2.53。
17.在一些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：将所述第一相和第二相分别用甲醇稀释至少5倍，然后过有机膜，分别得到京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷。
18.相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
19.本发明通过以绿色环保的低共熔溶剂构建两相体系作为萃取剂，可通过一步萃取完成对京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的萃取和分离，实现了对京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的有效分离，而且提取效率高，萃取剂用量较小。另外，萃取剂为低共熔溶剂，对环境污染小，绿色环保。
具体实施方式
20.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
21.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
22.下述实施方式所用京尼平苷酸标准品(≥98％)和桃叶珊瑚苷标准品(≥98％)均购自南京植物源生物有限公司；杜仲雄花购自张家界君健食品有限公司。
23.一、标准品溶液的制备：将京尼平苷酸标准品和桃叶珊瑚苷标准品分别溶于水中，然后混合均匀，得到标准品溶液。
24.二、建立双相体系并进行萃取分离
25.以不同的低共熔溶剂分别作为第一溶剂和第二溶剂，将第一溶剂和第二溶剂按体积比为1：1混合均匀形成混合溶液，然后加入标准品溶液，混合均匀，然后离心，得到分层的上相和下相溶液，将上相和下相溶液分离，然后分别用甲醇稀释五倍，过0.45μm有机膜，通过hplc分别测定上相和下相溶液种京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的浓度。具体地，不同的第一溶剂和第二溶剂的种类选择和选择性系数如表1所示。
26.表1第一溶剂和第二溶剂种类以及萃取效果
[0027][0028]
表1中，第一溶剂和第二溶剂均为由组分一和组分二混合进行反应组成的低共熔溶剂，每个溶剂的制备方法均为：将组分一和组分二按一定的摩尔比(如表2所示)混合，然后在80℃下搅拌至溶液呈澄清透明，得到低共熔溶剂。
[0029]
表2表1中所使用的第一溶剂和第二溶剂的组分和配比
[0030]
[0031]
根据上述标准品溶液的测试结果，下述实施例中拟将氯化胆碱-dl-苹果酸和四丁基氯化铵-己酸分别作为第一溶剂和第二溶剂，进行混合后构建双相体系，用于对杜仲雄花粗提液中的京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷进行萃取和分离，并考察第一溶剂和第二溶剂的体积比、杜仲雄花粗提液的浓度、第一溶剂含水量、萃取温度和杜仲雄花粗提液的ph值等因素对萃取效果的影响，当考察一个因素时，固定其他因素不变。具体如下：
[0032]
一、杜仲雄花粗提液的制备：
[0033]
利用粉碎机将杜仲雄花磨成粉末，用60目筛过滤；然后，将粉末置于烘箱中60℃烘干至恒重，并密封在聚乙烯包装袋中，备用；将40mg杜仲雄花粉末和20ml ph值为2.53的磷酸盐缓冲液加入锥形瓶中进行超声辅助固-液提取，温度为30℃，提取时间为30min。然后，用注射器滤膜过滤即得杜仲雄花粗提液。
[0034]
二、京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的萃取和分离：将第一溶剂氯化胆碱-dl-苹果酸和第二溶剂四丁基氯化铵-己酸按一定体积比加入离心管中，将离心管放在旋涡混合器上混合均匀，然后将离心管放在恒温水浴中，加入上述步骤一制备的杜仲雄花粗提液，涡流混合均匀后，将离心管置于离心机中离心。
[0035]
实施例1-6考察第一溶剂和第二溶剂的体积比的影响
[0036]
实施例1-6中，采用上述萃取和分离的方式对杜仲雄花粗提液进行萃取，区别在于第一溶剂和第二溶剂的体积比不同，其他条件相同，具体为：第一溶剂中的组分一和组分二摩尔比为1：1，第二溶剂中的组分一和组分二摩尔比为1：1，杜仲雄花粗提液加入量为0.5ml，浓度为2mol/ml，氯化胆碱-dl-苹果酸中不加入水，杜仲雄花粗提液的ph未作调整，温度的为25℃，具体体积比和萃取效果如表3和表4所示。
[0037]
表3第一溶剂和第二溶剂体积比和萃取效果
[0038][0039][0040]
表4gpa和au在第一溶剂和第二溶剂中的萃取效率
[0041][0042]
实施例7-11考察杜仲雄花粗提液的浓度的影响
[0043]
实施例7-11中，采用上述萃取和分离的方式对杜仲雄花粗提液进行萃取，区别在于杜仲雄花粗提液的浓度不同，即加入的0.5ml杜仲雄花粗提液中，所含提取物的质量不同；其他条件相同，具体为：第一溶剂和第二溶剂的体积比为1：3，第一溶剂氯化胆碱-dl-苹果酸中不加入水，杜仲雄花粗提液的ph未作调整，萃取温度为25℃。具体粗提液浓度和萃取效果如表5和表6所示。
[0044]
表5杜仲雄花粗提液的浓度和萃取效果
[0045][0046][0047]
表6gpa和au在第一溶剂和第二溶剂中的萃取效率
[0048][0049]
实施例12-17第一溶剂含水量的影响
[0050]
实施例12-17中，采用上述萃取和分离的方式对杜仲雄花粗提液进行萃取，区别在于第一溶剂中的含水量不同，具体见表6；其他条件相同，具体为：第一溶剂和第二溶剂体积比为1：3，加入0.5ml浓度为2mg/ml的杜仲雄花粗提液，杜仲雄花粗提液的ph值未作调整，萃取温度为25℃，第一溶剂中不同含水量的萃取效果如表7和表8所示。
[0051]
表7第一溶剂中具体含水量和萃取效果
[0052]
实施例氯化胆碱-dl-苹果酸含水量选择性系数(s)12合成不加水11.26135wt％10.901410wt％9.921515wt％7.601620wt％7.321725wt％6.77
[0053]
表8gpa和au在第一溶剂和第二溶剂中的萃取效率
[0054][0055]
实施例18-22萃取温度对萃取效果的影响
[0056]
实施例18-22中，采用上述萃取和分离的方式对杜仲雄花粗提液进行萃取，区别在于萃取温度不同，具体见表8；其他条件相同，具体为：第一溶剂和第二溶剂体积比为1：3，第一溶剂中不加入水，加入0.5ml浓度为2mg/ml的杜仲雄花粗提液，杜仲雄花粗提液的ph值未
作调整，萃取效果如表9和表10所示。
[0057]
表9不同萃取温度和萃取效果
[0058]
实施例萃取温度(℃)选择性系数(s)1854.6219157.54202510.8721355.8722455.80
[0059]
表10不同温度下gpa和au在第一溶剂和第二溶剂中的萃取效率
[0060][0061][0062]
实施例23-27杜仲雄花粗提液的ph不同的影响
[0063]
实施例23-27中，采用上述萃取和分离的方式对杜仲雄花粗提液进行萃取，区别在于，杜仲雄花粗提液的ph不同(通过加入不同ph的磷酸盐缓冲液进行调节，不同ph磷酸盐缓冲液的配制方法为：将磷酸二氢钾加入水中溶解，然后根据实际需求通过hcl溶液和naoh溶液调节，其中，hcl溶液和naoh溶液的浓度均为0.1mol/l)，具体如表10所示；其他条件相同，具体为：第一溶剂和第二溶剂体积比为1：3，第一溶剂中不加水，加入0.5ml浓度为2mg/ml的杜仲雄花粗提液，萃取温度为25℃，萃取效果如表11和表12所示。
[0064]
表11杜仲雄花粗提液的不同ph值和萃取效果
[0065]
实施例杜仲雄花粗提液的ph值选择性系数(s)232.5371.9924444.18255.0141.84266.5313.74277.4613.46
[0066]
表12gpa和au在第一溶剂和第二溶剂中的萃取效率
[0067][0068]
综上所述，本发明的最优实施方案为：
[0069]
在25℃条件下，将氯化胆碱-dl-苹果酸和四丁基氯化铵-己酸按体积比为1：3混合均匀，然后加入ph值为4、浓度为2mg/ml的杜仲雄花粗提液，混合均匀，然后离心，得到分层的上相和下相溶液，将上相和下相溶液分离，分别得到富含京尼平苷酸的溶液和富含桃叶珊瑚苷的溶液，其中，氯化胆碱-dl-苹果酸不含水。接着分别将富含京尼平苷酸的溶液和富含桃叶珊瑚苷的溶液分别用甲醇稀释至少5倍，过0.45μm有机膜，分别得到京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷。
[0070]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0071]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征：1.一种分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：将杜仲雄花粗提液与萃取剂混合，萃取，得到富含京尼平苷酸的第一相和富含桃叶珊瑚苷的第二相；所述萃取剂由第一溶剂和第二溶剂组成，所述第一溶剂为氯化胆碱-甘油、氯化胆碱-丙二酸、氯化胆碱-乙二酸、氯化胆碱-dl-苹果酸中的一种；所述第二溶剂为四丁基氯化磷-丙酸、甲基三辛基氯化铵-己酸、三正辛基氧膦-丙酸、四丁基氯化铵-己酸中的一种。2.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，所述第一溶剂和所述第二溶剂的体积比为1～3：0.5～2.5。3.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，提取温度为5～45℃。4.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，杜仲雄花粗提液的ph值为2.53～7.46。5.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，所述第一溶剂的含水量为5wt％～25wt％。6.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，所述粗提液的浓度为0.5～8mg/ml。7.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，所述杜仲雄花粗提液通过以下方法制得：将杜仲雄花磨成粉末，过筛，然后用磷酸盐缓冲液进行提取，过滤，得到杜仲雄花粗提液。8.根据权利要求7所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的ph为2.0～4.0。9.根据权利要求1所述的分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将所述第一相和第二相分别用甲醇稀释至少5倍，然后过有机膜，分别得到京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷。
技术总结本发明提供了一种分离京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷的方法，通过将不同的低共熔溶剂作为第一溶剂和第二溶剂进行混合作为萃取剂构建两相体系对杜仲雄花粗提液进行萃取，实现对杜仲雄花粗提液中的京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷进行有效萃取和分离，且分离效果好。此外，所使用的溶剂均为绿色环保的低共熔溶剂，对环境友好。对环境友好。
技术研发人员：谭志坚 刘磊磊 王艺聪 易永健 余旺 曾粮斌 杨媛茹 汪洪鹰
受保护的技术使用者：中国农业科学院麻类研究所
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/7/4
