1.本发明属于藏红花酸应用领域，具体涉及藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用。
背景技术：2.藏红花酸(c20h24o4，cas：27876-94-4)是一种天然存在的，具有广泛的生理活性的类胡萝卜素物质，化学学名为8,8
′‑
diapo-ψ,ψ
′
carotenedioic acid，其为砖红色结晶，熔点285℃，不溶于水和大多数有机溶剂。经研究表明藏红花酸具有抗癌、抑制肿瘤、降血脂、护肝、淬灭自由基、抗氧化等作用，已广泛应用于已广泛应用于功能性食品以及妇科疾病药物、抗肿瘤药物、慢性病毒性肝炎药物、动脉粥样硬化药物等药物中。但是，目前，关于藏红花酸具有抗疲劳效果方面的研究尚未被发现。
3.目前，抗疲劳药物主要是化学药物，此类药物虽然具有抗疲劳的作用，但大多为中枢神经系统兴奋剂，可能引起成瘾和依赖，限制了其临床应用。因此，将藏红花酸应用到抗疲劳药物和功能性食品当中，将极大地减轻现有抗疲劳药物成瘾和依赖的困境。
技术实现要素：4.本发明的目的在于提供藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，以解决背景技术中的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用方法为藏红花酸独立使用，或与其他抗疲劳成分的联合使用。
7.藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用形式为藏红花酸、藏红花酸盐、藏红花酸的络合物、藏红花酸的纳米载体、藏红花酸的水凝胶、藏红花酸的包裹物中的一种或几种。
8.进一步地，所述藏红花酸盐为本领域技术人员熟知的藏红花酸盐，如包括藏红花钾，藏红花钠盐等。
9.进一步地，所述藏红花酸的络合物为本领域技术人员熟知的藏红花酸与金属离子形成的络合物，金属离子如铁离子、钙离子等。
10.进一步地，所述藏红花酸的纳米载体为本领域技术人员熟知的脂质体、纳米乳化液等。
11.进一步地，所述藏红花酸的脂质体的原料包括藏红花酸和卵磷脂。
12.进一步地，所述藏红花酸的水凝胶为本领域技术人员熟知的藏红花酸与凝胶物质形成的水凝胶体系，凝胶物质如海藻酸钙、透明质质酸、聚乙二醇等。
13.进一步地，所述藏红花酸的复合物包括藏红花酸-环糊精复合物。
14.进一步地，所述藏红花酸的纳米载体包括红花酸的纳米脂质体。
15.藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用剂型为医学和食品上认可的
任何一种，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、饮料(包括酒)。
16.本发明的另一方面，验证了藏红花酸的纳米脂质体在小白鼠力竭游泳的抗疲劳活性试验中的作用，发现了藏红花酸显著提高了小白鼠力竭游泳时间，具体见下面实施例中的相关描述。
17.本发明的有益效果：
18.通过小白鼠力竭游泳的抗疲劳活性试验说明，藏红花酸具有明显地的抗疲劳效果。
附图说明
19.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
20.图1：为实施例3中的测试图；图1a为空白纳米脂质体与藏红花酸的纳米脂质体的粒径；图1b为空白纳米脂质体与藏红花酸的纳米脂质体的pdi值；图1c为空白纳米脂质体与藏红花酸的纳米脂质体的电位；
21.图2：为实施例4中的透射电镜图；图2a为空白纳米脂质体的透射电镜图；图2b为藏红花酸的纳米脂质体的透射电镜图；
22.图3：实施例6中与疲劳相关参数的测定；其中nc组表示自然对照组，mc组表示模型对照组，vc组表示抗坏血酸组，lp组表示空白纳米脂质体组，cr组表示藏红花酸组，nl表示纳米脂质体组，cr-nl表示藏红花酸的纳米脂质体组；图3a为小鼠力竭游泳时间；图3b为肝糖原含量；图3c为丙二醛(mda)含量；图3d为尿素氮(bun)含量；图3e为乳酸(lactic)含量；图3f为乳酸脱氢酶(ldh)的含量；图3g为琥珀酸脱氢酶(sdh)的含量；图3h为gsh-px酶含；
23.图4：实施例6中与疲劳相关参数的测定；其中nc组表示自然对照组，mc组表示模型对照组，vc组表示抗坏血酸组，lp组表示空白纳米脂质体组，cr组表示藏红花酸组，nl表示纳米脂质体组，cr-nl表示藏红花酸的纳米脂质体组；图4a为atp酶的mrna表达量；图4b为tfam的mrna表达量；图4c为ampk的mrna表达量；图4d为ampk蛋白表达量；图4e为p-ampk蛋白表达量；图4f为pgc-1α蛋白表达量；
24.图5-图12：实施例6中与肠道微生物相关的参数；其中nc组表示自然对照组，mc组表示模型对照组，vc组表示抗坏血酸组，lp组表示空白纳米脂质体组，cr组表示藏红花酸组，nl表示纳米脂质体组，cr-nl表示藏红花酸的纳米脂质体组；图5为物种的花瓣图；图6为rank abundance分析，横坐标，otu按照其所包含的序列数从多到少进行排序，例如“500”代表样本中丰度排名第500位的otu；纵坐标，该otu的相对丰度，例如“0.01”代表0.01％，“0.1”代表0.1％；图7为门水平下，相对丰度为前15的物种柱状图；图8为属水平下，相对丰度为前15的物种柱状图；
25.图9为香农指数(shannon index)图；图10为辛普森指数(simpsom index)图；图11为chao1指数；图12为不同组观测到的物种总数。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都
属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.藏红花酸的纳米脂质体：
29.实施例1-1：将25mg藏红花酸，500mg 70％纯度卵磷脂溶于20ml无水乙醇中，待到完全溶解后，得溶液a；然后在400r/min搅拌状态下，向100ml去离子水中快速注入，得溶液a，并保持搅拌状态持续搅拌60min，然后将反应液在45℃下旋转蒸发，完全除去无水乙醇，再用去离子水定容到100ml，得到粗藏红花酸的纳米脂质体，经超声处理10min(超声条件脉冲频率为5s：5s，功率为240w)，最后依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜，即可。
30.在本实施例中，所得藏红花酸的纳米脂质体的浓度为0.25mg/ml，卵磷脂浓度为5mg/ml。
31.实施例1-2：按照藏红花酸和卵磷脂的加入质量比为1:20，采用实施例1-1中的步骤和方法，得高剂量藏红花酸的纳米脂质体，且藏红花酸的纳米脂质体中藏红花酸浓度为1mg/ml，卵磷脂浓度为20mg/ml。
32.实施例2
33.空白纳米脂质体的制备：与实施例1-1相比，将藏红花酸换成等质量的去离子水即可，其余步骤相同。
34.实施例3
35.dls表征：
36.用zetasizer nano zs90激光粒度仪测定实施例2制备的空白纳米脂质体和实施例1-1制备的藏红花酸的纳米脂质体的粒径，多分散性系数和zeta电位。
37.如图1所示，空白纳米脂质体的粒径是69.31
±
0.26nm，包封藏红花酸之后粒径有所增长，为76.29
±
0.20nm。空白纳米脂质体的pdi是0.265
±
0.008，包封藏红花酸之后的pdi是0.281
±
0.031，均低于0.3。空白纳米脂质体的zeta电位为-25.63
±
0.67mv，藏红花酸的纳米脂质体的zeta电位为-41.23
±
3.80mv，说明脂质体体系稳定，提高了藏红花酸的水溶性。
38.实施例4
39.透射电镜表征藏红花酸纳米脂质体形态结构：
40.如图2所示，空白纳米脂质体的形态呈现球结构，粒径在60-70nm之间，包封藏红花酸后，脂质体的结构仍然呈现规则的球状结构，粒径稍微有增长，大约在80-90nm之间。
41.实施例5
42.包封率的测定
43.纳米脂质体对藏红花酸的包封率(ee％)采用紫外可见光分光光度计测定，简要地来说，用盐酸调节藏红花酸的纳米脂质体的ph为1.5，然后再6000g离心15min，除去游离的藏红花酸分子。取上清液(去除游离藏红花酸后的脂质体溶液)，用无水乙醇破坏脂质体结构，使之释放出被包封的藏红花酸，在440nm处测定吸光值。藏红花酸的包封率ee％用下面公式计算：
44.ee％＝包封的藏红花酸/总的藏红花酸
×
100％；通过计算，实施例1-1中藏红花酸的纳米脂质体对藏红花酸的包封率为55.63
±
1.61％。
45.实施例6
46.抗疲劳活性测定：
47.雄性icr小鼠(2-3周，16-18g)分为6组，分为正常对照组(nc)，模型对照组(mc)，vc组(vc)，空白脂质体组(lp)，实施例1-1制备的藏红花酸的纳米脂质体低剂量组(crl，藏红花酸的纳米脂质体的浓度为0.25mg/ml)和实施例1-2制备的藏红花酸的纳米脂质体高剂量组(crh，藏红花酸的纳米脂质体中藏红花酸浓度为1mg/ml)，持续灌胃6周，随后测试了强迫负重力竭游泳时间和疲劳相关的各种生化指数，mrna和dna表达丰度和肠道微生物组成变化。
48.如图3所示，藏红花酸脂质体显著提高了小鼠的力竭游泳时间，尤其是藏红花酸的纳米脂质体低剂量组，同时测量各种生化指标发现，藏红花酸给药显著提高了小鼠体内肝糖原的含量。与模型组相比，藏红花酸给药降低了小鼠体内尿素氮(bun)的含量，说明减少了小鼠机体在疲劳过程中对体内蛋白的氧化分解。图3e中，藏红花酸的纳米脂质体显著减少了小鼠体内乳酸的含量，乳酸的积累是导致疲劳产生的重要原因之一，与nc组相比，藏红花酸给药会提高小鼠体内乳酸脱氢酶的含量，这会有助于减少乳酸的含量。此外，与mc组相比，载藏红花酸增加了小鼠肌肉组织中琥珀酸脱氢酶的含量，这会有助于促进提高机体有氧呼吸的水平，产生更多的atp来抵抗疲劳的产生。图3h显示，藏红花酸的纳米脂质体给药还会增加小鼠体内gsh-px酶的含量，gsh-px不仅具有清除自由基和衍生物的作用，还减少脂质过氧化物的形成，增强机体抗氧化损伤的能力，这些都有助于减轻疲劳。综上，疲劳的产生过程伴随着多种代谢物的产生和各种酶的生成，灌胃藏红花酸的纳米脂质体后，会对疲劳的症状有较好的缓解作用。
49.为了进一步说明藏红花酸产生抗疲劳效果的机理，采集了力竭游泳小鼠的腓肠肌组织，对腓肠肌组织中的atp合成酶的mrna进行了扩增，通过western blot检测了ampk/pgc-1α蛋白的表达量，如图4所示：mc组小鼠腓肠肌组织中atp酶的mrna转录水平显著下降，这也说明疲劳导致了小鼠体内atp合成减少，导致能量供应不足。同时，小鼠腓肠肌组织中线粒体转录因子a(tfam)的mrna转录水平也显著下降，说明疲劳通过损伤小鼠腓肠肌组织中线粒体的功能和生物生成来降低能量的供应；与此同时，crl组和crh组的atp酶的mrna转录水平较mc组显著增加，并且与nc组无显著性差异，说明藏红花酸可以通过保护线粒体功能来增加atp生成，维持小鼠在运动过程中的能量供给。western blot结果显示，藏红花酸激活了ampk/pgc-1α通路，与nc组相比上调了ampk和p-ampk蛋白的表达量，并且过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(pgc-1α)的表达量也被上调。
50.综上，本发明中的在荷载藏红花酸纳米脂质体可以通过激活ampk途径增加线粒体的生物发生，进一步增加atp的生成量来促进能量供应，因此对疲劳小鼠的运动能力产生了一定促进效应，换言之，经过动物实验证明，藏红花酸纳米脂质体具有良好的抗疲劳效应。
51.最后，通过16srna测序对疲劳小鼠的肠道微生物的群落结构进行了α多样性分析和β多样性分析，结果如图5-图12所示。结果显示，长时间藏红花酸的纳米脂质体的摄入会显著改变肠道微生物的群落结构，其中lp组检测到的微生物群落总数显著下降(图5，图6)，其中厚壁菌门和拟杆菌门的肠道微生物相对丰度增加(图7，图8)。shannon指数和simpson指数显示疲劳小鼠在喂食不同抗疲劳制剂后，各组的肠道微生物在群落结构上有显著性差异(图9，图10)，chao1指数显示抗疲劳食品的摄入导致检测到的out水平显著下降(图11)，同时根据图12，疲劳后观测到的肠道微生物的种数也显著下降，并且喂食抗疲劳制剂之后，
肠道微生物的在种水平上仍然呈现减少的现象。通过肠道微生物的多样性分析，发现疲劳与肠道微生物群落的变化有着复杂且密切的联系，疲劳会导致肠道微生物的群落结构发生改变，喂食抗疲劳食物亦可改变肠道微生物的群落组成，这些改变同时对抗疲劳效应有着正面的促进效应，通过保护小肠粘膜屏障的完整性，以及产生一些小分子代谢物为小肠上皮细胞供应能量。
52.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
53.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：1.藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，其特征在于，藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用方法为藏红花酸独立使用，或与其他抗疲劳成分的联合使用。2.根据权利要求1所述的藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，其特征在于，藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用剂型为医学和食品上认可的任何一种，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、饮料。3.根据权利要求1所述的藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，其特征在于，藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用形式为藏红花酸、藏红花酸盐、藏红花酸的络合物、藏红花酸的纳米载体、藏红花酸的水凝胶、藏红花酸的复合物中的一种或几种。4.根据权利要求3所述的藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，其特征在于，所述藏红花酸的纳米载体包括藏红花酸的脂质体，藏红花酸的脂质体的原料包括藏红花酸和卵磷脂。5.根据权利要求3所述的藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，其特征在于，所述藏红花酸的纳米脂质体在水溶液中的平均粒径为50-1000nm，分散性系数为0.1-0.4，且zeta电位为-25mv至-45mv。
技术总结本发明涉及藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用，属于藏红花酸应用领域。藏红花酸作为抗疲劳成分在药物和食品方面的应用方法为藏红花酸独立使用，或与其他抗疲劳成分的联合使用，应用形式为藏红花酸、藏红花酸盐、藏红花酸的络合物、藏红花酸的纳米载体、藏红花酸的水凝胶、藏红花酸的复合物中的一种或几种，应用剂型为医学上认可的任何一种，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、饮料。且本发明制备了藏红花酸的纳米脂质体，且该载藏红花酸的纳米脂质体对藏红花酸的包封率为55.63
技术研发人员：李井雷 南剑 张温清 赵庆生
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/7/4
