1.本发明属于生物医学技术领域，具体地，本发明涉及一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术：2.干燥综合征(sjogren syndrome，ss)是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫性疾病，干燥综合征根据发病原因可分为原发性干燥综合征(primary sjogren syndrome，pss)和继发性干燥综合征(secondary sjogren syndrome，sss)两种，随着疾病的进展，pss可造成多器官、多系统受累。pss的患病率约为0.1％-1％，仅次于类风湿关节炎，居第二位，男女比例为1:9，目前其发病机制仍不明确，pss被认为是一个起源于遗传因素与能够触发异常自身免疫应答的外源性因素之间的相互作用而发病的多因素致病过程。在特定表观遗传因素、遗传易感性和激素调节的作用下，触发外分泌腺上皮细胞(sgec)功能失调，在pss的发病中至关重要，是t淋巴细胞、b细胞过活跃和自身抗体产生的基础。除涎腺、腮腺、泪腺等外分泌腺以外，pss还可累及皮肤、关节、肺、肾、心脏、血管等多种器官以及周围神经系统。肾间质损害是pss肾损伤中最常见的病理类型，其次为肾小球肾炎。干燥综合征肾损害非常隐匿，临床症状不突出，只有约4.2％的患者有明显肾脏损害的临床表现，可见对干燥综合征肾损害的发病病因和病理机制的研究至关重要。
3.干燥综合征肾损害不仅起病隐蔽病程长，而且发病的病因和病理机制尚无明确的定论，所以对该病的研究就显得异常的迫切。建立动物模型并利用动物疾病模型来研究人类疾病，可以克服平时一些不易见到，而且不便于在病人身上进行实验的各种人类疾病的研究。同时还可克服人类疾病发生发展缓慢、潜伏期长、发病原因多样、经常伴有各种其它疾病等因素的干扰，可以用单一的病因，在短时间内复制出典型的动物疾病模型，对于研究人类各种疾病的发生、发展规律和防治疾病疗效的机理等是极为重要的手段和工具。实验动物是生物医学研究中不可或缺的工具，实验动物在探究基因基础功能、探寻疾病的发病机制以及应用药物的临床前筛选等方面都有着十分重要的作用。小鼠在发育和代谢上与人类具有极大的相似性，其基因与人类基因也具有极高的相似度(小鼠99％的基因能在人类基因组中找到同源基因)，且其生命周期短，被认为是哺乳动物中理想的模式生物。随着生物医学研究的不断发展，目前本领域仍缺乏干燥综合征肾损害相关的动物疾病模型，因此，提供一种成模率高、造模时间短、操作简单的干燥综合征肾损害小鼠疾病模型的构建方法仍是本领域亟待解决的问题。
技术实现要素：4.为了弥补本领域存在的干燥综合征肾损害小鼠模型这一技术空白，本发明的目的在于提供一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用。
5.本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
6.本发明的第一方面提供了一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法。
7.进一步，所述方法包括如下步骤：
8.对小鼠施用含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂，得到干燥综合征肾损害小鼠模型。
9.进一步，所述小鼠为c57bl/6小鼠；
10.优选地，所述c57bl/6小鼠为雌性c57bl/6小鼠；
11.更优选地，所述雌性c57bl/6小鼠为8周龄的雌性c57bl/6小鼠。
12.进一步，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式包括皮下注射、静脉注射、腹腔注射或肌肉注射；
13.优选地，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式为皮下注射。
14.在本发明的具体实施例中，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式为皮下注射，皮下注射刺激免疫系统产生的应答显著强于其他途径。
15.进一步，所述小鼠肾小管抗原的制备包括如下步骤：
16.取小鼠的肾脏组织，加入消化酶进行消化，过滤制得悬液，对悬液进行离心取上清，制得小鼠肾小管抗原溶液；
17.优选地，所述小鼠为c57bl/6小鼠；
18.更优选地，所述c57bl/6小鼠为雌性c57bl/6小鼠；
19.最优选地，所述雌性c57bl/6小鼠为8周龄的雌性c57bl/6小鼠；
20.优选地，所述消化酶为胶原酶ⅳ。
21.进一步，在本发明的具体实施方式中，所述小鼠肾小管抗原的制备包括如下步骤：按需要取c57bl/6小鼠，脱颈椎处死，75％酒精消毒，无菌条件下取出双侧肾脏，剥离包膜及结缔组织，用pbs洗净后放入无菌青霉素小瓶中，按照每个肾脏加入0.5ml pbs的量，向无菌青霉素小瓶中加入pbs，将瓶内的肾脏剪碎并转移到2ml细胞冻存管中，加入1.25mg/ml的胶原酶ⅳ2ml于37℃的条件下消化1小时，每15分钟吹打一次使其消化更均匀，先后使用70μm和40μm的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液。在冰浴中将悬液充分匀浆，3000r、20min、4℃的条件离心，取上清液，采用bca蛋白定量法定量肾脏抗原浓度，用pbs将肾小管抗原浓度调整至2mg/ml(或1mg/ml)。
22.进一步，所述bca蛋白定量法是本领域技术人员常用的一种蛋白定量的方法。bca(bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和bca相互作用，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性的，在562nm处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此，可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白的浓度。
23.进一步，所述弗氏佐剂包括fca弗氏完全佐剂或fia弗氏不完全佐剂。
24.进一步，所述弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂(fia)是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1-5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2-20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即得完全弗氏佐剂(fca)。一般首次注射时用1/2体积fca加上1/2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为1：1，制备
成“油包水”乳状液。因为含sds很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。
25.进一步，所述佐剂与抗原乳化的方法包括但不限于如下方法：
26.(1)研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。该法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大；
27.(2)注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但同时难以乳化完全，个别抗原，用塑料注射器推动较为困难，而用玻璃注射器又有渗漏。制备好的乳化剂经鉴定才能使用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的可用于后续实验研究的油包水剂；
28.(3)超声法：采用超声破碎仪进行佐剂与抗原的乳化，操作过程中一定要控制超声频率和时间，超声容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。乳化方法要根据抗原和需要而定。
29.在本发明的具体实施例中，所述佐剂与抗原乳化的方法为注射器混合法。
30.进一步，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的制备包括如下步骤：
31.在2mg/ml的肾小管抗原溶液中加入等量fca弗氏完全佐剂制备得到fca弗氏完全佐剂配制的1mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂；
32.在1mg/ml的肾小管抗原溶液中加入等量fia弗氏不完全佐剂制备得到fia弗氏不完全佐剂配制的0.5mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂。
33.进一步，加入等量fca弗氏完全佐剂或fia弗氏不完全佐剂，将小鼠肾小管抗原浓度稀释至1mg/ml后，需反复吹打直至两液互溶并呈乳白色状。
34.进一步，分别在第0天、第7天于小鼠的颈背部皮下注射fca弗氏完全佐剂配制的1mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂，在第14天于小鼠的颈背部皮下注射fia弗氏不完全佐剂配制的0.5mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂；
35.优选地，所述注射的量为0.1ml/只。
36.进一步，本发明通过具体的实施例证明了以1mg/ml的浓度给予0.1ml/只较适宜，过高或过低易诱导免疫耐受。
37.在本发明的具体实施例中，本发明将c57bl/6小鼠的肾小管匀浆与弗氏佐剂制成乳化剂，通过皮下多点注射进入同种小鼠的颈背部，介导炎症免疫反应，使小鼠产生淋巴细胞浸润，干扰其免疫系统。皮下多处注射的方式可以产生较强的免疫应答。抗原的注射分3次进行，在第0天和第7天用弗氏完全佐剂调整抗原浓度，第14天用弗氏不完全佐剂平行操作，加强局部免疫应答。
38.进一步，本发明所述的注射抗原的次数和间隔适宜，频繁注射可能引起小鼠生理和精神状态低下，易于死亡。
39.本发明的第二方面提供了小鼠肾小管抗原在制备干燥综合征肾损害小鼠模型中的应用；
40.优选地，所述小鼠肾小管抗原为根据上述的制备方法制备得到的小鼠肾小管抗原。
41.在本发明的具体实施例中，本发明首次发现只采用小鼠肾小管抗原+佐剂免疫小鼠的方法即可构建得到干燥综合征肾损害的小鼠模型，为本领域提供了一种干燥综合征肾损害小鼠模型，为干燥综合征肾损害的发病机制和干预策略的研究提供了基础。
42.本发明的第三方面提供了根据本发明的第一方面所述的构建方法构建得到的小鼠模型在筛选用于治疗和/或预防干燥综合征肾损害的药物中的应用。
43.本发明的第四方面提供了一种筛选用于治疗和/或预防干燥综合征肾损害的药物的方法。
44.进一步，所述方法包括如下步骤：
45.(1)将待测试药物施用于本发明第一方面所述的构建方法构建得到的小鼠模型中；
46.(2)分析待测试药物的治疗效果并进行评价，选择能够明显改善小鼠模型干燥综合征肾损害病理特征的测试药物。
47.进一步，本发明还提供了对制备得到的干燥综合征肾损害小鼠模型进行验证的方法，所述方法包括如下步骤：
48.将c57bl/6小鼠随机分组，保证各组的小鼠数量、体重、状态尽可能地相近；用剪刀或电动剃须刀将小鼠颈背部的毛剃掉以备注射抗原，正常对照组小鼠不作处理；
49.分别在第0天，第7天于小鼠的颈背部皮下多点注射上述制备得到的fca配制的1mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂；在第14天用同样的方法注射等量的上述制备得到的fia配制的肾小管抗原(0.5mg/ml)乳化剂，注射量为0.1ml/只；对照组小鼠用同样的方法注射等量的生理盐水；
50.造模6周左右，检测指标，筛选造模成功的小鼠模型，所述检测指标包括：小鼠状态观察、饮水量检测、唾液量检测、血清生化分析、尿液生化分析、肾脏及颌下腺组织病理学检测、透射电镜观察肾小管上皮细胞超微结构；
51.优选地，所述血清生化分析方法为：于6周末处死小鼠，留取血清检测肌酐、尿素氮、钾；
52.优选地，所述尿液生化分析方法为：处死小鼠前代谢笼留取24小时尿液，检测尿量、尿渗透压、尿总蛋白、尿微量白蛋白、尿磷、尿钾、尿钙；
53.优选地，所述肾脏及颌下腺组织病理学检测方法为：于6周末处死小鼠，取肾脏及颌下腺做病理检查，用h&e染色法进行检测，光镜下观察模型组小鼠的病理学改变。
54.优选地，所述唾液量检测方法为：测量前小鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠0.2ml，以呼吸平稳，眼角膜反射消失，四肢肌群松弛为麻醉标准；完全麻醉后使小鼠处于头低的稍倾斜状态，可以用保温垫给予温度，腹腔注射0.025mg/ml毛果芸香碱溶液0.1ml，5分钟后，将事先称好的棉花小球塞入小鼠口中，10分钟后取出；用湿重法求出小鼠唾液重量。
55.优选地，所述肾脏及颌下腺组织病理学检测方法为：于6周末处死小鼠，取肾脏及颌下腺做病理检查，用h&e染色法检测，组织的处理应先放于10％的福尔马林中浸泡24小时后，依次进行冲洗、脱水和透明、浸蜡、包埋、石蜡切片以及最终的h&e染色。
56.相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
57.(1)本发明首次提供了一种干燥综合征肾损害的小鼠模型，并提供了所述干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法，解决了目前本领域存在的缺乏干燥综合征肾损害小鼠模型这一技术问题，为干燥综合征肾损害的发病机制和干预策略的研究提供了基础；
58.(2)本发明提供的干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法具有成模率高、造模时间短、操作简单等优点，对构建得到的干燥综合征肾损害小鼠模型进行实验验证发现，该小鼠模型具有干燥综合征肾损害的病理特征，可用于干燥综合征肾损害治疗药物的筛选中；
59.(3)与现有技术相比，本发明首次发现只采用小鼠肾小管抗原+佐剂免疫小鼠的方法即可构建得到干燥综合征肾损害小鼠模型，本发明提供的这一构建方法不仅具有高效、快速、经济的优点，而且极易推广并广泛使用，具有很好的应用价值。
附图说明
60.图1为本发明所述的干燥综合征肾损害小鼠模型的构建与验证实验流程图；
61.图2为本发明构建得到的干燥综合征肾损害小鼠饮水量、唾液量、24小时尿量、血生化及尿生化分析结果；
62.图3为elisa法检测小鼠血清中抗ssa/ssb抗体水平结果图，其中，a图：anti-ssa，b图：anti-ssb；
63.图4为肾脏he染色光镜图，其中，a图：对照组，放大400倍，b图：肾小管蛋白免疫组，放大400倍；
64.图5为颌下腺he染色光镜图，其中，a图：对照组，分别放大100倍和放大400倍，b图：肾小管蛋白免疫组，分别放大100倍和放大400倍；
65.图6为肾脏透射电镜图，其中，a图：对照组近端小管上皮细胞刷状缘，放大11000倍，b图：对照组近端小管上皮细胞线粒体，放大13000倍，c图，肾小管蛋白免疫组近端小管上皮细胞刷状缘，放大11000倍，d-f图，肾小管蛋白免疫组近端小管上皮细胞线粒体，放大13000倍。
具体实施方式
66.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
67.实施例干燥综合征肾损害小鼠模型的构建与验证
68.本发明所述的干燥综合征肾损害小鼠模型的构建与验证实验流程图详见图1。
69.1、实验材料
70.c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，6周龄，雌性，饲养于北京协和医院实验动物中心spf级实验室，温度23
±
1℃，湿度50％-60％，不限制饮食。动物购进实验室前进行了1周的检验检疫，结果合格，1周后转入指定实验室进行适应性饲养1周。该小鼠实验方案已受北京协和医院实验动物福利伦理委员会批准。
71.2、药物和试剂
72.弗氏完全佐剂(cfa)：购自美国sigma公司(f5881)；
73.弗氏不完全佐剂(ifa)：购自美国sigma公司(f5506)；
74.磷酸盐缓冲液(pbs)：购自北京索莱宝科技有限公司(p1020)；
75.胶原酶ⅳ：购自美国sigma公司(c0130)。称取100mg溶于10ml pbs中配制成10mg/ml，使用时稀释成所需浓度(1.25mg/ml)；
76.戊巴比妥钠：购自美国sigma公司。白色粉末，称取1.0g溶于100ml双蒸水配制成溶液(1.0％)，剂量以体重20g的小鼠腹腔注射0.2ml；
77.毛果芸香碱：购自美国selleck公司(s4231)。白色粉末，称取10mg溶于10ml双蒸水中配制成1mg/ml，使用时稀释成所需浓度(0.025mg/ml)，剂量以体重20g的小鼠腹腔注射0.1ml；
78.bca蛋白浓度测定试剂盒：购自北京索莱宝科技有限公司(pc0020)；
79.红细胞裂解液：购自北京索莱宝科技有限公司(r1010)；
80.苏木素伊红(h&e)染色试剂盒：购自北京索莱宝科技有限公司(g1120)。3、干燥综合征肾损害小鼠模型的构建过程
81.(1)小鼠肾小管抗原的制备：按需要取c57bl/6小鼠，脱颈椎处死，75％酒精消毒，无菌条件下取出双侧肾脏，剥离包膜及结缔组织，用pbs洗净后放入无菌青霉素小瓶中，按照每个肾脏加入0.5ml pbs的量，向无菌青霉素小瓶中加入pbs，将瓶内的肾脏剪碎并转移到2ml细胞冻存管中，加入1.25mg/ml的胶原酶ⅳ2ml于37℃消化1小时，每15分钟吹打一次使其消化更均匀，先后使用70μm和40μm的筛网进行过滤去除未消化的组织以及肾小球，得悬液。在冰浴中将悬液充分匀浆，3000r/20min/4℃的条件离心，取上清液，采用bca蛋白定量法定量肾脏抗原浓度，用pbs将肾小管抗原浓度调整至2mg/ml，加入等量fca弗氏完全佐剂或fia弗氏不完全佐剂，将小鼠肾小管抗原浓度稀释至1mg/ml(或0.5mg/ml)，反复吹打直至两液互溶并呈乳白色状，即制得注射用的1mg/ml(或0.5mg/ml)小鼠肾小管抗原；
82.(2)将8周龄的雌性c57bl/6小鼠随机分组，保证各组的小鼠数量、体重、状态尽可能地相近；用剪刀或电动剃须刀将小鼠颈背部的毛剃掉以备注射抗原，正常对照组小鼠不作处理；
83.(3)分别在第0天，第7天于小鼠的颈背部皮下多点注射步骤(1)中制备得到的fca弗氏完全佐剂配制的1mg/ml小鼠肾小管抗原，注射量为0.1ml/只；在第14天用同样的方法注射等量的步骤(1)制备得到的fia弗氏不完全佐剂配制的肾小管抗原(肾小管抗原的终浓度为0.5mg/ml)；对照组小鼠用同样的方法注射等量的生理盐水；
84.(4)造模6周左右，检测指标，所述检测指标包括小鼠状态观察、饮水量检测、唾液量检测、血清生化分析、尿液生化分析、肾脏及颌下腺组织病理学检测、透射电镜观察肾小管上皮细胞超微结构，筛选造模成功的小鼠；
85.小鼠状态观察：在造模后第3周左右，小鼠出现搔抓口唇、舔爪现象，随后这种现象逐渐明显；
86.饮水量检测：于造模前一周开始检测，每周测一次；造模后饮水量开始逐渐上升；
87.唾液量检测：在造模后第5周进行；在造模第5周及此后，模型组小鼠的唾液量应比正常组低，并且逐渐减少；
88.血清生化分析：于6周末处死小鼠，留取血清检测肌酐、尿素氮、钾；
89.尿液生化分析：处死小鼠前代谢笼留取24小时尿液，检测尿量、尿渗透压、尿总蛋白、尿微量白蛋白、尿磷、尿钾、尿钙；
90.肾脏及颌下腺组织病理学检测：于6周末处死小鼠，取肾脏及颌下腺做病理检查，用h&e染色法进行检测，光镜下可见模型组小鼠的肾小管上皮细胞肿胀、空泡样改变，管腔内可见脱落细胞，间质灶状淋巴细胞浸润，不伴有肾小球病变及小管萎缩，模型组小鼠的颌下腺存在明显的淋巴细胞浸润、成灶，而正常组无明显浸润；
91.唾液量检测的方法为：测量前小鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠0.2ml，以呼吸平稳，眼角膜反射消失，四肢肌群松弛为麻醉标准；完全麻醉后使小鼠处于头低的稍倾斜状态，可以用保温垫给予温度，腹腔注射0.025mg/ml毛果芸香碱溶液0.1ml，5分钟后，将事先称好的棉花小球塞入小鼠口中，10分钟后取出；用湿重法求出小鼠唾液重量；
92.肾脏及颌下腺组织病理学检测方法为：于6周末处死小鼠，取肾脏及颌下腺做病理检查，用h&e染色法检测，组织的处理应先放于10％的福尔马林中浸泡24小时后，依次进行冲洗、脱水和透明、浸蜡、包埋、石蜡切片以及最终的h&e染色；
93.此外，采用elisa法检测小鼠血清中抗ssa/ssb抗体水平，以验证各组小鼠血清抗ssa/ssb抗体的水平。
94.4、实验分组
95.实验组为本实施例中构建得到的干燥综合征肾损害小鼠模型3只，对照组为采用同样的方法注射等量的生理盐水得到8周龄的雌性c57bl/6小鼠3只，阳性对照组为皮下注射颌下腺蛋白抗原(2mg/ml)得到8周龄的雌性c57bl/6小鼠3只。
96.5、实验结果
97.结果显示，与对照组相比，皮下注射肾小管蛋白组小鼠有抓挠口唇的现象，且饮水量、尿量显著增加，唾液量显著减少；与对照组相比，皮下注射肾小管蛋白组小鼠血清肌酐、尿素氮无变化，血钾则显著降低；与对照组相比，皮下注射肾小管蛋白模型组小鼠出现低渗尿，皮下注射肾小管蛋白组小鼠24小时尿钾、尿磷、尿钙、尿蛋白及尿微量白蛋白排泄均显著增加(见图2)；
98.elisa法检测小鼠血清中抗ssa/ssb抗体水平的结果显示，与对照组相比，皮下注射肾小管蛋白组(1mg/ml)小鼠血清抗ssa/ssb抗体水平显著升高；皮下注射肾小管蛋白组(1mg/ml)小鼠血清抗ssa/ssb抗体水平与阳性对照组(皮下注射颌下腺蛋白抗原组(2mg/ml)作为阳性对照组)无显著差异(见图3)；
99.肾脏he染色光镜结果图显示，与对照组相比，光镜下可见皮下注射肾小管蛋白组(1mg/ml)小鼠肾小管上皮细胞肿胀、空泡样改变，间质灶状淋巴细胞浸润，不伴有肾小球病变及小管萎缩，黑色箭头所指为肾小管上皮细胞肿胀、空泡样改变，白色箭头所指为间质灶状淋巴细胞浸润(见图4)；
100.颌下腺he染色光镜结果图显示，皮下注射肾小管蛋白组(1mg/ml)小鼠颌下腺存在明显的淋巴细胞浸润、成灶，而正常组无明显浸润，白色箭头所指为灶状淋巴细胞浸润(见图5)；
101.肾脏透射电镜结果图显示，皮下注射肾小管蛋白组(1mg/ml)小鼠肾小管上皮细胞刷状缘倒伏、断裂，线粒体变小、膜密度增加、嵴减少或消失、外膜断裂，细胞核大小正常，但缺乏染色质凝聚(见图6)；
102.以上得到的唾液分泌减少、多饮、尿崩、低血钾、血清抗ssa/ssb阳性、肾脏及颌下腺组织间质灶状淋巴细胞浸润等结果均表明了本发明构建得到的小鼠模型为干燥综合征肾损害的小鼠模型。且结果显示以1mg/ml小鼠肾小管抗原的浓度给予0.1ml/只小鼠最优，过高或过低均易诱导免疫耐受。
103.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
技术特征：1.一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：对小鼠施用含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂，得到干燥综合征肾损害小鼠模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠为c57bl/6小鼠；优选地，所述c57bl/6小鼠为雌性c57bl/6小鼠；更优选地，所述雌性c57bl/6小鼠为8周龄的雌性c57bl/6小鼠。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式包括皮下注射、静脉注射、腹腔注射或肌肉注射；优选地，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式为皮下注射。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠肾小管抗原的制备包括如下步骤：取小鼠的肾脏组织，加入消化酶进行消化，过滤制得悬液，对悬液进行离心取上清，制得小鼠肾小管抗原溶液；优选地，所述小鼠为c57bl/6小鼠；更优选地，所述c57bl/6小鼠为雌性c57bl/6小鼠；最优选地，所述雌性c57bl/6小鼠为8周龄的雌性c57bl/6小鼠；优选地，所述消化酶为胶原酶ⅳ。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述弗氏佐剂包括fca弗氏完全佐剂或fia弗氏不完全佐剂。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的制备包括如下步骤：在2mg/ml的肾小管抗原溶液中加入等量fca弗氏完全佐剂制备得到fca弗氏完全佐剂配制的1mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂；在1mg/ml的肾小管抗原溶液中加入等量fia弗氏不完全佐剂制备得到fia弗氏不完全佐剂配制的0.5mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂。7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，分别在第0天、第7天于小鼠的颈背部皮下注射fca弗氏完全佐剂配制的1mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂，在第14天于小鼠的颈背部皮下注射fia弗氏不完全佐剂配制的0.5mg/ml小鼠肾小管抗原乳化剂；优选地，所述注射的量为0.1ml/只。8.小鼠肾小管抗原在制备干燥综合征肾损害小鼠模型中的应用；优选地，所述小鼠肾小管抗原为根据权利要求4中所述的制备方法制备得到的小鼠肾小管抗原。9.根据权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的小鼠模型在筛选用于治疗和/或预防干燥综合征肾损害的药物中的应用。10.一种筛选用于治疗和/或预防干燥综合征肾损害的药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将待测试药物施用于权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的小鼠模型中；(2)分析待测试药物的治疗效果并进行评价，选择能够明显改善小鼠模型干燥综合征肾损害病理特征的测试药物。
技术总结本发明公开了一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用，本发明首次发现只采用小鼠肾小管抗原和佐剂免疫小鼠的方法即可构建得到同时表现为干燥综合征和肾损害的小鼠模型，所述方法不仅具有高效、快速、经济的优点，而且极易推广并广泛适用，具有很好的应用价值。价值。价值。
技术研发人员：陈丽萌 马田田 施潇潇 陈华
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/7/4
