本披露涉及双保护的活化的鸟嘌呤单体、其合成方法以及其在反义寡核苷酸的生产中的用途。
背景技术：
1、反义寡核苷酸(aso)以序列特异性方式用于调节基因表达。它们已被开发用于靶标验证和治疗目的。反义技术具有治愈由有害基因的表达引起的疾病(包括由病毒感染、癌症生长、神经元退化(即阿尔茨海默病)和炎性疾病引起的疾病)的潜力。优化的反义寡核苷酸(aso)可以用于靶向初级基因转录物、一种或多种mrna产物、剪接和未剪接的编码和非编码rna。
2、aso通过两种广泛的机制调节rna功能。空间阻断机制，其可能导致剪接调节、无义介导的衰变(nmd)和翻译阻断。以及rna酶h介导的降解，其通过制造rna-aso异源双链体而导致靶rna的切割。
技术实现思路
1、磷二酰胺吗啉代寡聚物(pmo)是短的单链dna类似物，这些类似物含有由磷二酰胺键连接的吗啉环的骨架。据报道，它们在某些疗法中是有用的。
2、被修饰用于生产pmo的一种核酸单体是鸟嘌呤。这些单体的鸟嘌呤碱基可以被修饰以保护鸟嘌呤碱基在生产pmo期间不参与副反应。当鸟嘌呤单体的鸟嘌呤碱基被单保护时，稳定性问题开始出现。鉴于鸟嘌呤单体的这种特征，我们提供了双保护的活化的鸟嘌呤单体，其相对于单保护的鸟嘌呤单体具有改善的稳定性。这些更稳定的鸟嘌呤单体可以用于以较低的副产物形成发生率和较高的产率来生产pmo。
3、一个实施例是双保护的活化的鸟嘌呤单体或其药学上可接受的盐。当单体已被制备用于导致合成二聚体或寡聚物的另外的步骤中时，该单体被称为是“活化的”。
4、在一些实施例中，双保护的活化的鸟嘌呤单体包含根据式i的活化的吗啉环：
5、
6、其中r1、r2选自h、(r)-甲基或(s)-甲基、c1-c4烷基、苯基、芳基、环烷基或其任何组合；并且
7、其中r3选自nh2、-nhc(o)r7、-nhc(o)or7、并且其中r7可以是c1-c6烷基、异丙基、2,2,2-三氯乙基、苄基或芳基。
8、在一些实施例中，r1和r2可以连接在一起以形成c3至c7环烷基环或包含氧和/或氮的杂环的环，所有这些可以是饱和的或不饱和的，并且可以在一个或多个碳原子处被c1-c6烷基取代。
9、在其他实施例中，双保护的活化的鸟嘌呤单体是具有式i的立体异构体。不限于以下结构，双保护的活化的鸟嘌呤单体的一些实施例包含根据式(ia)和(ib)中的一种的立体异构结构。
10、
11、在一些实施例中，双保护的活化的鸟嘌呤单体包含根据式ii的活化的四氢呋喃环：
12、
13、其中r1、r2选自h、(r)-甲基或(s)-甲基、c1-c4烷基、苯基、芳基、环烷基或其任何组合；
14、其中r3选自nh2、-nhc(o)r7、-nhc(o)or7、并且其中r7可以是c1-c6烷基、异丙基、2,2,2-三氯乙基、苄基或芳基；
15、其中r4选自h、三苯甲基(tr)、单甲氧基三苯甲基(mmtr)、二甲氧基三苯甲基(dmtr)、-si(r8)3、其中r8是c1-c6烷基或芳基；并且
16、其中r5选自h、-ome、-f或-och2ch2ome。
17、在其他实施例中，r5和r6可以连接在一起以形成c3至c7环烷基环或包含氧和/或氮的杂环的环，所有这些可以是饱和的或不饱和的，并且可以是未取代的或被c1-c6烷基取代。例如，在一个实施例中，r5和r6可以连接在一起以形成s-cet，如以下描绘的(在整个分子的背景下)：
18、在另一个实施例中，r5和r6形成lna，其具有以下所描绘的结构(在整个分子的背景下)：
19、
20、在其他实施例中，r1和r2可以连接在一起以形成c3至c7环烷基环或包含氧和/或氮的杂环的环，所有这些可以是饱和的或不饱和的，并且可以是未取代的或被c1-c6烷基取代。
21、在一些实施例中，双保护的活化的鸟嘌呤单体是具有式ii的立体异构体。不限于以下结构，双保护的活化的鸟嘌呤单体的一些实施例包含根据式(iia)和(iib)的立体异构结构。
22、
23、在其他实施例中，双保护的活化的鸟嘌呤单体可以由以下结构表示：
24、
25、
26、在一些实施例中，双保护的活化的鸟嘌呤单体具有以下结构：
27、
28、本文所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体可以由包括以下步骤的方法生产：
29、i)使根据式(iii)的受保护的鸟嘌呤单体：
30、
31、与醇在碱的存在下反应以生产根据式iv的受保护的鸟嘌呤中间体：
32、式iv
33、其中r是
34、其中r1和r2选自h、(r)-甲基或(s)-甲基、c1-c4烷基、苯基、芳基、环烷基或其任何组合，包括其中r可以是选自以下结构的基团：
35、
36、ii)使根据式iv的受保护的鸟嘌呤中间体与三乙胺三氢氟酸盐反应以生产根据式v的脱保护的鸟嘌呤中间体：
37、
38、
39、iii)使根据式v的脱保护的鸟嘌呤中间体与溴化锂、第二活化剂和n,n-二甲基磷氨基二氯化物反应以产生本文所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体。
40、在一些实施例中，步骤(i)中使用的试剂是n-甲基吡咯烷、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)、奎宁环、三甲胺及其任何组合。
41、在其他实施例中，步骤(i)中使用的碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、二异丙基乙胺、碳酸钾、叔丁醇钾、氢化钠、na2co3、csco3、吡咯烷、三乙胺、吡啶及其任何组合。
42、在一些实施例中，步骤(i)中使用的醇可以是3-羟基-2-甲基丙腈、3-羟基-3-甲基丙腈或2,3-二甲基-3-羟甲基丙腈。步骤(i)中使用的醇还可以是3-羟基-2-甲基丙腈、3-羟基-3-甲基丙腈或2,3-二甲基-3-羟甲基丙腈的任何立体异构体。
43、在一些实施例中，步骤(iii)中使用的第二活化剂是dbu、2,6-二甲基吡啶、n-甲基咪唑、1h-四唑、4,5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、lihmds、4-乙基吗啉、dmap、三乙胺、吡啶、hunig碱及其任何组合。
44、在一些实施例中，步骤(i)、(ii)或(iii)的反应可以进一步包括溶剂。溶剂可以是dcm、乙酸乙酯、乙腈，thf、甲苯、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、dmf或其任何组合。
45、在一些实施例中，本文所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体可以由包括以下步骤中的任何步骤并且在一些实施例中包括以下步骤中的所有步骤的方法生产：
46、i)使根据式vi的鸟嘌呤单体：
47、
48、与第一保护剂反应，以生产根据式(vii)的第一受保护的鸟嘌呤单体：
49、
50、ii)使该具有式(vii)的受保护的鸟嘌呤单体与第二保护剂反应以生产根据式(viii)的受保护的鸟嘌呤单体：
51、
52、iii)使具有式(viii)的第二受保护的鸟嘌呤单体与活化剂反应以生产根据式(ix)的受保护的鸟嘌呤单体：
53、
54、其中a1是由与该活化剂的反应形成的离去基团；
55、iv)使具有式(ix)的受保护的鸟嘌呤单体与选定的醇反应以生产根据式(x)的受保护的鸟嘌呤单体：
56、
57、v)用脱保护剂将该根据式(x)的受保护的鸟嘌呤单体脱保护以生产根据式(xi)的受保护的鸟嘌呤单体：
58、
59、vi)使根据式(xi)的受保护的鸟嘌呤单体与亲电试剂反应以生产根据式ii的受保护的鸟嘌呤单体。
60、在一些实施例中，步骤iv)包括使具有式(ix)的受保护的鸟嘌呤单体与4-(羟甲基)苯基新戊酸酯反应以生产根据式(xii)的受保护的鸟嘌呤单体：
61、
62、在其他实施例中，步骤v)包括使根据式(xii)的受保护的鸟嘌呤单体与脱保护剂反应以生产根据式(xiii)的受保护的鸟嘌呤单体：
63、
64、在一些实施例中，步骤vi)包括使根据式(xiii)的受保护的鸟嘌呤单体与亲电试剂反应以生产具有以下结构的化合物：
65、
66、在一些实施例中，第一保护剂可以是三苯甲基氯、4-单甲氧基三苯甲基氯、4,4'-二甲氧基三苯甲基氯、或包含式(si(r6)3)cl的氯硅烷，其中r6是c1-c6烷基或芳基。在一些实施例中，氯硅烷是叔丁基二甲基氯硅烷。
67、在其他实施例中，第二保护剂可以是三苯甲基氯、4-单甲氧基三苯甲基氯、4,4'-二甲氧基三苯甲基氯、或包含式(si(r6)3)cl的氯硅烷，其中r6是c1-c6烷基或芳基。在一些实施例中，氯硅烷是叔丁基二甲基氯硅烷。
68、在其他实施例中，活化剂是2,4,6-三异丙基苯磺酰氯。
69、在一些实施例中，a1是可以被1至3个烷基取代的芳基磺酰基、三氟甲磺酰基、甲磺酰基及其组合。
70、在其他实施例中，步骤iv)中的醇是或4-(羟甲基)苯基新戊酸酯。
71、在其他实施例中，亲电试剂是
72、可以将额外的试剂和/或溶剂添加到步骤i)至vi)中的任何一个或多个。这些试剂可以选自dbu、dmap、三乙胺、n-甲基吡咯烷、libr、2,6-二甲基吡啶、n-甲基咪唑或其组合。添加到步骤i)至vi)中任何一个或多个的溶剂可以是dcm、thf、mecn、甲苯、dmf、水或其组合。
1.一种根据式i的双保护的活化的鸟嘌呤单体：
2.根据权利要求1所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，该鸟嘌呤单体是具有式i的立体异构体，其包含根据式ia的结构：
3.根据权利要求1所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，该鸟嘌呤单体是具有式i的立体异构体，其包含根据式ib的结构：
4.根据权利要求1所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，r1是h并且r2是(r)-甲基或(s)-甲基。
5.根据权利要求1所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，r1是(r)-甲基或(s)-甲基并且r2是h。
6.一种根据式ii的双保护的活化的鸟嘌呤单体：
7.根据权利要求6所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，该鸟嘌呤单体是具有式ii的立体异构体，其包含根据式iia的结构：
8.根据权利要求6所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，该鸟嘌呤单体是具有式ii的立体异构体，其包含根据式iib的结构：
9.根据权利要求6所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，r1是h并且r2是(r)-甲基或(s)-甲基。
10.根据权利要求6所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体，其中，r1是(r)-甲基或(s)-甲基并且r2是h。
11.一种用于生产根据权利要求1所述的双保护的活化的鸟嘌呤单体的方法，其中，该方法包括：
12.根据权利要求11所述的方法，其中，该第一和第二活化剂是dbu并且该碱是n-甲基吡咯烷。
13.一种产生双保护的活化的鸟嘌呤单体的方法，其中该方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中，该第二保护剂是叔丁基二甲基氯硅烷。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，该活化剂是2,4,6-三异丙基苯磺酰氯。
16.根据权利要求13所述的方法，其中，a1是
17.根据权利要求13所述的方法，其中，该第三保护剂是
18.根据权利要求13所述的方法，其中，该脱保护剂是三氟乙酸。
19.根据权利要求13所述的方法，其中，该亲电试剂是
20.一种产生双保护的活化的鸟嘌呤单体的方法，其中该方法包括：
21.根据权利要求20所述的方法，其中，该保护剂是4-(羟甲基)苯基新戊酸酯。
22.一种根据以下结构中任一项的双保护的活化鸟嘌呤单体：
