本技术涉及烟草加工领域，具体而言，本技术涉及一种枯草芽孢杆菌及其细胞，以及包含其的组合物、培养物、酶制剂或酶制品和由其制备的烟草原料或其制品。本技术还涉及所述枯草芽孢杆菌及其细胞、组合物、培养物在制备酶制剂或酶制品中的用途，以及所述枯草芽孢杆菌及其细胞、组合物、培养物、酶制剂或酶制品在烟草原料或其制品的加工中的用途。
背景技术：
1、随着烟草行业的发展和社会对卷烟产品提质降焦的需求逐渐增大，高品质烟叶的需求也在日益增加。因而低品质烟叶存量高，高品质烟叶供不应求的结构性矛盾日益凸显。为了缓解供求矛盾、提高低品质烟叶的可用性和感官品质，烟叶的提质研究一直被广泛的关注。近期研究中经常采用的改善卷烟原料品质的方法主要为外源添加法、微生物发酵法、和生物酶法。生物酶法通过微生物发酵生产和蛋白纯化等工艺，制备多种生物酶制剂而后在打叶复烤，加香加料、膨胀烟丝等环节添加于卷烟原料，改善卷烟原料品质，提高其使用价值。生物酶法因为其生产周期短，条件温和、易于操作，改善效果明显，在实际应用中具有一定优势，被越来越广泛地应用到烟叶预处理和卷烟的生产中。同时，因其可以有效降解烟叶中的大分子，生成芳香性物质或香味前体物，提升卷烟口感和实用价值，同时具有效率高，条件温和，成本低廉等优势，已成为烟草工业的研究重点之一。生产烟用酶制剂的功能微生物可分为烟草源和非烟草源两类。烟草源功能微生物筛选自烟叶表面、土壤、烟叶浸提液等，能很好的适合烟叶生化环境，产生的酶制剂作用于烟草制品后，其感官品质整体协调性好。
2、自2009年以来，国内烟草行业开始在应用生物技术在烟草发酵与提质增香领域积极布局。在具体技术领域方面，应用微生物菌剂或酶制剂对烟叶进行人工发酵是专利布局的重点，其中涉及到的微生物以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。然而，生产烟用酶制的功能微生物的筛选具有工作量大、周期长的弊端；同时，通过筛选的野生菌外泌蛋白组成复杂，对烟叶有提质效果的外泌酶产量有待提高。因此，为满足生产需要，常常需要复杂的培养及优化与发酵优化，工艺探索周期长。
3、随着现代分子生物学的发展，运用生物工程的和代谢工程的手段，可以在底盘细胞中专一的表达酶制剂、提高酶产量。然而，目前通用的蛋白表达底盘细胞例如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母等，对于烟用酶制剂的表达与生产的适应性未明，同时其产生的酶制剂对感官质量的协调性均有待评估。
技术实现思路
1、本技术的发明人经过大量实验从上千株烟草烟叶来源的微生物中筛选到了一株全新枯草芽孢杆菌菌株，与工业生产中常用的枯草芽孢杆菌相比，具有显著提升的产酶能力与烟草行业适应性。本技术的发明人通过大量实验证实，该枯草芽孢杆菌与传统工业生产中常用的枯草芽孢杆菌相比，具有更高的生长优势和对营养环境的适应能力(例如能够将碱性木素作为唯一碳源)，还具有更高的产酶能力(使果胶酶酶活至少提高了4.6倍)。并且，将表达果胶酶pela的外源载体转化到本技术的枯草芽孢杆菌菌株并制备发酵液喷施烟叶，还提高了烟草原料或其制品的抽吸感官质量(例如香气质，香气量，杂气、细腻程度、刺激性、余味)。由此，申请人完成了本发明。
2、因此，在第一方面，本技术提供了一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或其细胞，所述枯草芽孢杆菌保藏编号为cgmcc no.31465。
3、在某些实施方案中，第一方面所述的枯草芽孢杆菌包含保藏编号为cgmccno.31465的枯草芽孢杆菌菌株的后代。如本文中所使用的，术语“后代”是指微生物通过生长(例如培养基中培养生长)而产生的子代细胞。易于理解的是，在微生物的生长和培养中，尤其是细菌的生长和培养中，遗传物质可能发生一定的变化(例如，一个或几个碱基的突变)，这些变化可以是自发发生，也可以是因化学和/或物理试剂(例如诱变剂)诱变和/或本领域已知的重组dna技术而导致的结果。因此，在本文中，枯草芽孢杆菌的后代意欲涵盖与本发明的枯草芽孢杆菌相比遗传物质未发生变化和发生变化的后代。当然，所述后代仍然保留其所衍生自的保藏编号为cgmcc no.31465的枯草芽孢杆菌菌株的功能(例如，能够将碱性木素作为唯一碳源，具有更高的产酶能力)。
4、在某些实施方案中，第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：启动子pveg的核苷酸序列，编码果胶酶pela的核苷酸序列和编码果胶酶pela的信号肽的核苷酸序列。
5、如本文所用，术语“核酸”能够为任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的dna、rna，其长度不受任何特别的限制。对于用于构建重组构建体的核酸，优选所述核酸为dna，因为dna相对于rna而言，其更稳定，并且易于操作。
6、在某些实施方案中，所述核酸构建体从5’至3’方向依次包含：启动子pveg的核苷酸序列，编码果胶酶pela的信号肽的核苷酸序列和编码果胶酶pela的核苷酸序列。
7、在某些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌与天然的枯草芽孢杆菌相比，能够产生增加量的果胶酶pela。在某些实施方案中，所述天然的枯草芽孢杆菌是来源于烟草的枯草芽孢杆菌。在某些实施方案中，所述天然的枯草芽孢杆菌是不包含核酸构建体的枯草芽孢杆菌。在某些实施方案中，所述天然的枯草芽孢杆菌是不包含核酸构建体的枯草芽孢杆菌yy-10和/或bs168。在某些实施方案中，所述天然的枯草芽孢杆菌是传统工业底盘细胞。
8、在某些实施方案中，所述核酸构建体以转化(例如，瞬时转化)的方式引入所述枯草芽孢杆菌或其细胞中。
9、如本文所使用的，术语“转化”或“转入”是指将外源核酸序列(例如，感兴趣的靶基因)导入细胞或组织的方法，包括但不限于稳定转化方法和瞬时转化方法。如本文所使用的，术语“稳定转化”是指导入的多核苷酸整合到宿主细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞)的基因组中，并且能够由其后代遗传。如本文所使用的，术语“瞬时转化”或“瞬时表达”是指将多核苷酸引入宿主细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞)中，而不整合到宿主细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞)的基因组中。在某些实施方案中，所述核酸构建体以瞬时转化的方式引入所述枯草芽孢杆菌或其细胞中。
10、在某些实施方案中，所述启动子pveg具有如seq id no:3所示的序列。
11、在某些实施方案中，所述果胶酶pela具有如seq id no:4所示的序列。
12、在某些实施方案中，所述果胶酶pela的信号肽具有seq id no:5所示的序列。
13、在某些实施方案中，所述核酸构建体包含如seq id no:6所示的序列。
14、在某些实施方案中，所述核酸构建体是载体。在某些实施方案中，所述载体是表达载体。
15、在第二方面，本技术提供了一种组合物，其包含如第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞。
16、在某些实施方案中，所述组合物还包含选自以下的微生物：细菌，真菌(例如酵母)，或其任何组合。
17、在某些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌可与一种或多种其他物种的微生物组合使用，所述其他物种的微生物能够对其施用的宿主(例如，烟草)的生长起到有益影响。
18、在某些实施方案中，所述微生物是益生菌。如本文所使用的，术语“益生细菌”被定义为任何非致病的细菌，并且将其以活菌向宿主施用足够数量时，能够对宿主的生长起到有益影响。
19、在某些实施方案中，所述细菌选自乳酸杆菌属，双歧杆菌属，芽孢杆菌属，丙酸杆菌属，链球菌属，乳球菌属，片球菌属，肠球菌属，葡萄球菌属，或其任何组合。
20、在某些实施方案中，所述酵母选自所述酵母选自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，布拉氏酵母(saccharomyces boulardii)，马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，或其任何组合。
21、在第三方面，本技术提供了一种培养物，所述培养物包含如第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或者如第二方面所述的组合物。
22、在某些实施方案中，所述组合物还包括额外的添加剂。本领域技术人员可以根据需求对额外的添加剂进行选择和调整。在某些实施方案中，所述额外的添加剂能够对其施用的宿主的健康起到有益影响。
23、在某些实施方案中，所述额外的添加剂选自其他营养物质(例如，碳源、氮源、维生素、矿物质、微量元素、生长因子，或其任意组合)。
24、在某些实施方案中，所述矿物质选自铁，锌，钾，钠，钙，镁，及其任何组合。
25、在某些实施方案中，所述维生素选自维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12，维生素a，维生素c,维生素d，维生素e，维生素k，及其任何组合。
26、在某些实施方案中，所述碳源选自碱性木素、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、纤维素、淀粉，或其任意组合。
27、在某些实施方案中，所述氮源选自氨水、蛋白胨、酵母提取物、大豆水解物，或其任意组合。
28、在某些实施方案中，所述培养物中包含或不包含抗生素(例如，卡那霉素和/或氨苄霉素)。
29、在某些实施方案中，根据用途、应用方式或施用方式的不同，所述培养物可以为固体、液体或者半固体。
30、在某些实施方案中，所述培养物还包含选自以下的微生物：细菌，真菌(例如酵母)，或其任何组合。
31、在某些实施方案中，所述培养物还包含提供营养的成分(例如，固体或液体培养基，饲养细胞层)。
32、在某些实施方案中，所述提供营养的成分选自蛋白质，碳水化合物，脂肪，益生菌，酶，维生素，矿物质，氨基酸，或其任何组合。
33、在某些实施方案中，所述培养物还包含枯草芽孢杆菌或其后代的无细胞培养滤液。
34、在某些实施方案中，所述培养物还包含枯草芽孢杆菌或其后代的衍生物。
35、在某些实施方案中，所述衍生物选自代谢产物，酶，细胞结构成分(例如，细胞壁或其成分)，胞外多糖，细菌素，含有免疫原性成分的化合物，或其任何组合。
36、在第四方面，本技术提供了一种酶制剂或酶制品，其包含第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或第二方面所述的组合物或第三方面所述的培养物。
37、在某些实施方案中，所述酶制品是发酵剂。
38、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品还包含另外的酶(例如，纤维素酶)。
39、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品为固体、液体或半固体。
40、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品为粉剂、片剂、颗粒粉剂、或液体剂的形式。
41、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品还包含缓冲液。
42、在第五方面，本技术提供了第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或第二方面所述的组合物或第三方面所述的培养物在制备酶制剂或酶制品中的用途。
43、在某些实施方案中，所述酶制品是发酵剂。
44、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品还包含另外的酶(例如，纤维素酶)。
45、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品为固体、液体或半固体。
46、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品为粉剂、片剂、颗粒粉剂、或液体剂的形式。
47、在某些实施方案中，所述酶制剂或酶制品还包含缓冲液。
48、在第五方面，本技术提供了一种烟草原料或其制品，其由第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或第二方面所述的组合物或第三方面所述的培养物或第四方面所述的酶制剂或酶制品制备获得。
49、在某些实施方案中，所述烟草原料或其制品经由第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或第二方面所述的组合物或第三方面所述的培养物或第四方面所述的酶制剂或酶制品涂抹、喷施、烤制或浸泡制备获得。
50、在某些实施方案中，所述烟草原料选自烟叶、片烟、梗丝、薄片、叶组烟丝，或其任意组合。
51、在某些实施方案中，所述烟草原料的制品为卷烟或烤烟。
52、在第六方面，本技术提供了第一方面所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或第二方面所述的组合物或第三方面所述的培养物或第四方面所述的酶制剂或酶制品在烟草原料或其制品的加工中的用途。
53、在某些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌或其细胞或组合物或培养物或酶制剂或酶制品，用于提高烟草原料或其制品的果胶酶的含量。
54、在某些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌或其细胞或组合物或培养物或酶制剂或酶制品，用于提升烟草原料或其制品的抽吸感官质量(例如，香气质、香气量、杂气、细腻程度、刺激性、余味)。
55、术语定义
56、如本文中所使用的，术语“果胶酶”是指一种能够分解果胶酸的蛋白。更具体的，所述蛋白是指pela基因编码的pela(pectate lyase a)蛋白。在某些实施方案中，本技术的果胶酶包含天然的果胶酶、以及经过突变的果胶酶，只要它们仍然保持有果胶酶的活性(即，分解果胶酸的活性)。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如genbank数据库)获得果胶酶的氨基酸序列。在某些实施方案中，示例性的果胶酶pela的氨基酸序列可如seqid no：4所示。
57、如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。
58、如本文中所使用的，术语“果胶酶pela的信号肽”是指存在于天然果胶酶pela多肽链n末端用于指导蛋白质的跨膜转移的氨基酸序列。在某些实施方案中，示例性的果胶酶pela的信号肽的氨基酸序列可如seq id no：5所示。
59、如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
60、如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。在本文中，所使用的启动子不局限于特定的启动子类型。
61、如本文中所使用的，术语“表达”是指，藉此从dna模板转录成多核苷酸(如转录成mrna或其他rna转录物)的过程和/或转录的mrna随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组dna，表达可以包括真核细胞中mrna的剪接。
62、发明的有益效果
63、本技术的枯草芽孢杆菌yy-10与最常应用于工业中的枯草芽孢杆菌bs168相比，至少具有下列的一项或多项特征：(1)具有更高的生长优势和对营养环境的适应能力(例如能够将碱性木素作为唯一碳源)；(2)具有更高的产酶能力(使果胶酶酶活至少提高了4.6倍)；(3)将表达果胶酶pela的外源载体转化到本技术的枯草芽孢杆菌菌株并制备发酵液喷施烟叶之后，还提高了烟草原料或其制品的抽吸感官质量(例如香气质，香气量，杂气、细腻程度、刺激性、余味)。
1.一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或其细胞，所述枯草芽孢杆菌保藏编号为cgmcc no.31465。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或其细胞，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：启动子pveg的核苷酸序列，编码果胶酶pela的核苷酸序列和编码果胶酶pela的信号肽的核苷酸序列；
3.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌或其细胞，其中，所述启动子pveg具有如seq id no:3所示的序列；
4.一种组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌或其细胞；
5.一种培养物，所述培养物包含权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或者权利要求4所述的组合物；
6.权利要求5所述的培养物，所述培养物还包含选自以下的微生物：细菌，真菌(例如酵母)，或其任何组合；
7.一种酶制剂或酶制品，其包含权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或权利要求4所述的组合物或权利要求5或6所述的培养物；
8.权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或权利要求4所述的组合物或权利要求5或6所述的培养物在制备酶制剂或酶制品中的用途；
9.一种烟草原料或其制品，其由权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或权利要求4所述的组合物或权利要求5或6所述的培养物或权利要求7所述的酶制剂或酶制品制备获得；
10.权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌或其细胞或权利要求4所述的组合物或权利要求5或6所述的培养物或权利要求7所述的酶制剂或酶制品在烟草原料或其制品的加工中的用途；
