本发明涉及微生物，具体涉及一种富硒长双歧杆菌菌剂及其制备方法。
背景技术：
1、随着现代生活节奏的加快和饮食习惯的改变，人们面临着越来越多的健康问题。其中，硒作为一种对人体至关重要的微量元素，已受到广泛关注。硒在人体内扮演着多种生物学角色，包括作为抗氧化酶的组成部分、调节甲状腺功能、增强免疫系统等。硒的缺乏与多种疾病有关，如心脏病、肝病、某些癌症以及免疫力下降等。
2、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)是人体肠道中的一种益生菌，对维持肠道微生态平衡、促进消化、增强免疫力具有重要作用。然而，传统的长双歧杆菌产品并未特别强调硒的补充，而硒的补充对于现代人来说尤为重要。
3、纳米技术的发展为微量元素的补充提供了新的途径。纳米硒因其高效的生物利用度和易于控制的剂量而备受关注。通过纳米技术制备的富硒长双歧杆菌菌剂，可以更有效地为人体提供有机硒，同时保持长双歧杆菌的活性和稳定性。
4、在传统的发酵工艺中，微生物的培养条件、营养物质的供应、ph值和温度等参数的控制对于最终产品的品质有着决定性的影响。然而，传统的发酵过程往往存在效率低下、成本较高以及产品品质不稳定等问题。
5、目前，缺乏一种富硒长双歧杆菌菌剂及其制备方法。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种富硒长双歧杆菌菌剂及其制备方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面是提供了一种富硒长双歧杆菌菌剂。本发明的第二方面是提供了一种富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法。本发明的第三方面是提供了一种富硒长双歧杆菌冻干粉的制备方法。
3、本发明的一种富硒长双歧杆菌菌剂，通过生物发酵工艺制备，含有可被机体吸收的有机硒，其中，菌剂中纳米硒的含量为5-100微克/克，并且长双歧杆菌的活性菌落数为1×109至5×1010cfu/克。
4、进一步地，富硒长双歧杆菌菌剂通过片剂、冻干粉、胶囊、乳制品、搅拌型酸奶或凝固形酸奶的形式提供。
5、本发明的富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
6、a.配制3l培养基，调节ph至5.5-7.0，装入5l发酵罐；
7、b.在121℃下灭菌20分钟，然后冷却至室温；
8、c.接入种子液30ml-180ml，作为1％-6％的接种量；
9、d.使用20％ naoh溶液控制发酵ph至5.5-6.5；
10、e.加入过滤除菌的纳米硒溶液，使终浓度达到20-50mg/l；
11、f.发酵8-10小时，期间通氮气驱除空气，并以50ml/h的速度恒速流加30％葡萄糖，制得富硒长双歧杆菌菌剂。
12、进一步地，发酵过程中使用的培养基配方包含以下组分组成：
13、
14、发酵参数为：发酵温度设置为35℃-42℃；发酵罐搅拌速度30rpm；发酵ph设置为5.5-6.5。
15、进一步地，在步骤(e)中，纳米硒溶液的制备方法，包括如下步骤：
16、(1)向烧杯中加入稳定剂；
17、(2)向烧杯中缓慢加入含有还原剂的水溶液，并在加入过程中保持磁力搅拌，直到稳定剂完全溶解；
18、(3)将亚硒酸钠水溶液缓慢加入到步骤(2)所得的溶液中，在加入过程中，步骤(2)的溶液处于磁力搅拌中；
19、(4)在亚硒酸钠水溶液加入完毕后，立即使用氢氧化钠溶液调节ph到预定范围，然后继续磁力搅拌30分钟，制得红色的纳米硒溶液。
20、进一步地，在步骤(1)中，稳定剂选自表没食子儿茶素没食子酸酯egcg、壳聚糖、阿拉伯胶、牛血清白蛋白bsa或透明质酸钠中的至少一种。
21、进一步地，在步骤(2)中，还原剂选自还原型谷胱甘肽gsh或维生素c(vc)中的至少一种；表没食子儿茶素没食子酸酯egcg的浓度范围为0.1mm-40mm；壳聚糖的浓度范围为0.01％-0.7％，壳聚糖的分子量范围为100kd-1000kd；阿拉伯胶的浓度范围为0.04％-0.4％，阿拉伯胶的分子量范围为200kd-2000kd；所述牛血清白蛋白bsa的浓度范围为0.4mg/ml-60mg/ml；透明质酸钠的浓度范围为0.02％-0.25％，透明质酸钠的分子量范围为200kd-2000kd。
22、更进一步地，在步骤(2)中，还原剂在反应体系中的终浓度为5mm-50mm(gsh)和5mm-100mm(vc)。
23、更进一步地，在步骤(3)中，亚硒酸钠在反应体系中的终浓度为5mm。
24、更进一步地，在步骤(4)中，调节ph的步骤中，ph值的范围为5.0-9.0。
25、通过上述步骤制备得到的纳米硒粒径分布峰值都能精准地控制在20nm-60nm。纳米硒在益生菌发酵条件下表现出良好的稳定性。
26、本发明的富硒长双歧杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
27、a.发酵结束后，以8000g离心10分钟，离心4次，离心温度为4℃；
28、b.使用20mm pbs、0.9％ nacl、5％脱脂奶粉、ph7.0的除菌溶液重悬菌泥，每50ml-100ml溶液重悬1克菌泥；
29、c.按照预设的冻干程序进行冻干，冻干程序包括预冻、主干燥和终末干燥步骤，制得富硒长双歧杆菌冻干粉；
30、d.使用脱脂奶粉或其他填充剂将冻干粉稀释到所需浓度。
31、进一步地，在步骤(d)中，以10克的5.0x1010cfu/g的富硒长双歧杆菌母粉稀释成50克的浓度为1.0x1010cfu/g的菌粉为例，采用梯度稀释法，首先称取10.0克5.0x1010cfu/g的母粉，加入2.5克的脱脂奶粉，混匀，得12.5克的4.0x1010cfu/g的菌粉；接着在12.5克的4.0x1010cfu/g的菌粉中加入12.5克的脱脂奶粉，混匀，得25.0克的2.0x1010cfu/g的菌粉；最后将25.0克的2.0x1010cfu/g的菌粉和25.0克的脱脂奶粉混匀，制得50.0克的浓度为1.0x1010cfu/g富硒长双歧杆菌冻干粉。
32、进一步地，预冻步骤在-45℃下进行，持续1.5小时至4小时；主干燥步骤在-45℃下进行60分钟，随后隔板温度从-45℃升至-25℃，升温耗时为1小时，之后在-25℃下保持10小时；终末干燥步骤包括从-25℃升温至0℃，升温耗时2小时，然后从0℃升温至20℃，升温耗时1小时，并在20℃下保持4小时。整个主干燥和周末干燥阶段，真空度保持为0.2mbar。
33、有益效果：本发明通过现代化的发酵工艺、精确的参数控制、优化的培养基配方、恒速流加的补料策略、高效的菌体收集和冻干工艺，以及精确的硒含量测定，实现了富硒长双歧杆菌菌剂的高效、稳定和规模化生产。
34、与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)精确控制：本发明通过精确控制纳米硒溶液的添加量，本发明富硒长双歧杆菌菌剂为消费者提供适量的有机硒补充。
35、(2)高效发酵过程：采用121℃灭菌20分钟和37℃恒温发酵，确保了长双歧杆菌的高效生长和繁殖，同时使用20％ naoh溶液精确控制ph值，保证了发酵过程的稳定性和菌体的活性。优化的培养基配方：通过特定的培养基配方，包括抗坏血酸钠、nacl、na2hpo4、kh2po4、葡萄糖和酵母蛋白胨等成分，为长双歧杆菌提供了适宜的生长环境，促进了菌体的健康成长。
36、(3)精确的补料控制：通过补料泵以恒定流速和转速向发酵罐中补充30％葡萄糖，确保了发酵过程中营养成分的均匀供应，进一步提高了菌体的生产效率。空气驱除技术：在接种前后和取样前后通氮气10分钟，有效驱除了罐内空气，避免了氧气对厌氧发酵过程的不利影响，保证了发酵环境的厌氧性。
37、(4)冻干粉的高活性保持：通过优化的冻干程序，包括预冻、主干燥和终末干燥步骤，有效保持了菌体的活性，使得冻干后的富硒长双歧杆菌菌剂在溶解后仍具有高活性。精确的成分分析：采用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)法对冻干粉中的硒含量进行精确分析，确保产品质量和安全性。
38、(5)促进健康：富硒长双歧杆菌菌剂作为一种营养补充品，可以为人体提供必需的硒元素，有助于增强免疫力、促进新陈代谢和维护肠道健康。广泛的应用前景：该富硒长双歧杆菌菌剂可广泛应用于食品、保健品和医药领域，作为一种功能性食品添加剂或膳食补充剂，具有广阔的市场应用潜力。
1.一种富硒长双歧杆菌菌剂，其特征在于：所述富硒长双歧杆菌菌剂通过生物发酵工艺制备，含有可被机体吸收的有机硒，其中，所述菌剂中纳米硒的含量为5-100微克/克，并且长双歧杆菌的活性菌落数为1×109至5×1010cfu/克。
2.权利要求1所述的富硒长双歧杆菌菌剂，其特征在于：所述纳米硒长双歧杆菌菌剂通过片剂、冻干粉、胶囊、乳制品、搅拌型酸奶或凝固形酸奶的形式提供。
3.权利要求1所述的富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(a)中，发酵过程中使用的培养基配方包含以下组分组成：
5.根据权利要求3所述的富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(e)中，所述纳米硒溶液的制备方法，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述稳定剂选自表没食子儿茶素没食子酸酯egcg、壳聚糖、阿拉伯胶、牛血清白蛋白bsa或透明质酸钠中的至少一种；在步骤(2)中，所述还原剂选自还原型谷胱甘肽gsh或维生素c中的至少一种；在步骤(3)中，所述亚硒酸钠在反应体系中的终浓度为5mm；在步骤(4)中，调节ph的步骤，ph值的范围为5.0-9.0；所述表没食子儿茶素没食子酸酯egcg的浓度范围为0.1mm-40mm；所述壳聚糖的浓度范围为0.01％-0.7％，壳聚糖的分子量范围为100kd-1000kd；所述阿拉伯胶的浓度范围为0.04％-0.4％，阿拉伯胶的分子量范围为200kd-2000kd；所述牛血清白蛋白bsa的浓度范围为0.4mg/ml-60mg/ml，所述透明质酸钠的浓度范围为0.02％-0.25％透明质酸钠的分子量范围为200kd-2000kd。
7.根据权利要求5所述的富硒长双歧杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述还原剂在反应体系中的终浓度为5mm-50mm的谷胱甘肽gsh和5mm-100mm的维生素c vc。
8.权利要求2所述的富硒长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的富硒长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于：
10.根据权利要求8所述的富硒长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于：在步骤(c)中所述冻干程序包括以下步骤：预冻步骤在-45℃下进行，持续1.5小时至4小时；主干燥步骤在-45℃下进行60分钟，随后隔板温度从-45℃升至-25℃，升温耗时为1小时，之后在-25℃下保持10小时；终末干燥步骤包括从-25℃升温至0℃，升温耗时2小时，然后从0℃升温至20℃，升温耗时1小时，并在20℃下保持4小时。整个主干燥和周末干燥阶段，真空度保持为0.2mbar。
