本发明涉及生物医药，特别是涉及一种基于分支滚环扩增检测mirna21的组合物、荧光传感器、方法及其应用。
背景技术：
1、微小rna(micrornas,mirnas)是一种小分子单链非编码rna，通过促进信使rna(messengerrna,mrna)的降解或阻止其转化为功能蛋白来调节转录后水平上的基因表达。mirna是肿瘤发生发展的重要调控因子，参与多种生物过程，如细胞的增殖、凋亡和转移等，并且与肿瘤的预后密切相关。越来越多的证据表明mirna可以将肿瘤组织同非肿瘤组织区分开来，具有成为人类肿瘤生物标志物的潜能。mirna可以稳定的存在于血浆、血清、尿液等体液中，并可能在一定程度上反映其母源细胞的状态，这均为其成为理想的生物标志物提供了优势。所有mirna序列中，mirna21尤其重要，因为它在肿瘤和非肿瘤病理中高表达，并涉及至少29种疾病(如心脏病、肝细胞癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、胃癌和前列腺癌)。因为mirna21在细胞中丰度不高，但是常见，相对表达量较其他mirna高，所以它可以在许多身体样本(例如，血清/血浆和尿液)中检测到，使其成为有用的靶生物标志物。
2、目前已有一些方法经常用于mirna的检测，包括免疫印迹法(western blotting,wb)，northern印迹(northern blotting,nb)，微阵列和实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qrt-pcr)。然而，这些方法有其固有的优点和缺点。例如，wb和nb费力、耗时、花费高且不敏感，其在实际诊断中的应用有限；微阵列由于灵敏度低、重复性差和特异性差而不能令人满意；qrt-pcr检测mirna是稳健可靠的，但整个过程不仅操作复杂而繁琐，包括从血液中的外泌体中分离mirna，延伸mirna，逆转录形成cdna，最后在不同温度下扩增该cdna，还需要昂贵的仪器，令人望而生畏，并增加了假阴性的风险。因此，上述方法的限制使得mirna检测一直受到阻碍，开发更加简单、快速，灵敏度更高，且特异性、稳定性和重复性更好的mirna检测新方法仍然任重而道远。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于分支滚环扩增(rolling circle amplification,rca)检测mirna21的组合物、荧光传感器、方法及其应用，为临床mirna21检测提供了一种等温、简单、快速、灵敏，具有良好的特异性、稳定性和重复性，且能实现低浓度检测的新策略。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于分支rca检测mirna21的组合物，包括：第一挂锁探针(pp1)、第二挂锁探针(pp2)、第二引物(pr2)及第二分子信标探针(mb2)；
3、所述第一挂锁探针与靶标mirna21序列部分互补，并能与mirna21经一级滚环扩增反应生成一级滚环扩增产物；
4、所述第二挂锁探针与所述一级滚环扩增产物序列部分互补，所述第二引物与第二挂锁探针序列部分互补；所述第二挂锁探针和第二引物能与所述一级滚环扩增产物经二级滚环扩增反应生成二级滚环扩增产物；
5、所述一级滚环扩增产物与二级滚环扩增产物组成分支滚环扩增产物，所述第二分子信标探针用于识别所述分支滚环扩增产物，且修饰有荧光基团和淬灭基团。
6、在一些实施例中，所述第一挂锁探针、第二挂锁探针、第二引物和第二分子信标探针的核苷酸序列依次如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.6所示，具体如下：
7、seq id no.2:
8、ctgataagctagaaactccataacatccaatccgacattcctctactattcaacatc agt；
9、seq id no.3:
10、tccgacattcctcctcccgcagttctaaccgattccaacgatcaaccattactcacccatcccataacatccaa；
11、seq id no.4:
12、gatgggtgagtaatggttgatc；
13、seq id no.6:
14、ctcccgcagttcaaccgattccaacaatcggtagaact。
15、进一步地，所述第一挂锁探针和第二挂锁探针的5’端均修饰有磷酸基团(p)。
16、在一些实施例中，所述荧光基团包括但不局限于fam、hex、tet、rox、tamra、joe、cy等，例如6-fam、6-hex、6-tet、6-rox、6-tamra、6-joe、cy3、cy5等。
17、在一些实施例中，所述淬灭基团包括但不局限于bhq、……等，例如bhq1、bhq2等。
18、在一些实施例中，所述组合物还包括以下组分中至少一种：dna连接酶、dna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)和缓冲液。
19、在一些实施例中，所述dna连接酶包括但不局限于t4 dna连接酶等。
20、在一些实施例中，所述dna聚合酶包括但不局限于phi29 dna聚合酶等。
21、在一些实施例中，所述缓冲液包括但不局限于t4 dna连接酶缓冲液、phi29 dna聚合酶缓冲液等。
22、本发明第二方面提供一种采用第一方面所述的组合物构建基于分支rca检测mirna21的荧光传感器的方法，包括以下步骤：
23、(a)将待测样本、所述第一挂锁探针和所述第二挂锁探针混合构建形成分支滚环扩增反应体系，并进行孵育；
24、(b)取步骤(a)所得产物，加入所述第二引物，并进行孵育；
25、(c)将所述第二分子信标探针加入步骤(b)所得反应液中，孵育得到分支滚环扩增荧光检测体系。
26、在一些实施例中，所述步骤(a)、(b)和(c)中，孵育温度均为32～42℃，优选为37℃。
27、在一些实施例中，所述步骤(a)、(b)和(c)中，孵育时间均30～60min，优选为60min。
28、在一些实施例中，所述步骤(a)、(b)和(c)中，所述第一挂锁探针、第二挂锁探针、第二引物与第二分子信标探针的摩尔用量比为1:40～60:80～100:400～600，例如1:50:90:500。
29、在一些实施例中，所述步骤(a)中，所述分支滚环扩增反应体系中还加入了以下组分中的至少一种：dna连接酶、dna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)和缓冲液。
30、在一些实施例中，所述步骤(b)中，还加入了以下组分中的至少一种：dna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)和缓冲液。
31、在一些实施例中，所述方法还包括步骤(d)：检测所述分支滚环扩增荧光检测体系的荧光信号，根据检测得到的荧光信号判断所述待测样本中是否存在靶标mirna21或所述待测样本是否为mirna21。
32、在一些实施例中，所述步骤(d)中，荧光信号检测参数包括：激发波长520nm，发射波长范围490～600nm。
33、在一些实施例中，当所述待测样本中存在靶标mirna21或所述待测样本为mirna21，且所述第二分子信标探针识别到所述分支滚环扩增产物时，所述第二分子信标探针会被打开而恢复被淬灭的荧光信号。
34、本发明第三方面提供一种根据第二方面所述的方法构建得到的基于分支rca检测mirna21的荧光传感器。
35、本发明第四方面提供一种基于分支rca检测mirna21的方法，采用第一方面所述的组合物和/或第三方面所述的荧光传感器。
36、本发明第五方面提供根据第一方面所述的组合物和/或根据第二方面所述的构建荧光传感器的方法和/或根据第三方面所述的荧光传感器在制备mirna21检测试剂中的应用。
37、如上所述，本发明的基于分支rca检测mirna21的组合物、荧光传感器、方法及其应用，具有以下有益效果：
38、(1)本发明提出了一种mirna21检测新策略，该策略采用本发明提供的组合物结合分支rca和荧光信号输出能构建得到分支rca荧光检测体系，并实现mirna21的等温、简单、快速、灵敏检测，且本发明采用的分支rca相较于传统的rca技术，信号增强近9倍。
39、(2)本发明的分子信标探针能特异性地与分支rca产物结合，从而产生荧光，并且自组装形成的分支rca产物能显著增强分子信标探针的荧光信号以使荧光信号进一步放大，从而提高对靶物质检测的灵敏度和特异性。
40、(3)现有的mirna21检测技术，对实验条件要求严格，且操作过程复杂，涉及高温变性退火等步骤；而本发明提供的检测方案可以全程在等温条件下下进行，操作简单，无需变温即可实现mirna21的灵敏检测。
41、(4)现有mirna检测技术中，由于mirna丰度较低，低浓度的mirna21检测受到了限制；但本发明通过两次rca反应，就可以放大荧光信号，轻松实现对低浓度mirna21的检测，较传统的mirna检测方法具有更低的检测限，且检测限低至am级。
42、(5)本发明利用分支rca荧光检测体系识别mirna21，与传统方法相比，本发明仅需要简单设计第一挂锁探针pp1、第二挂锁探针pp2、第二引物pr2、第二分子信标探针mb2的dna序列，在dna连接酶、dna聚合酶、dntps等的帮助下就可以成功建立整个荧光检测体系，大大降低了检测的难度和检测成本。
1.一种基于分支rca检测mirna21的组合物，其特征在于，包括：第一挂锁探针、第二挂锁探针、第二引物及第二分子信标探针；
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述第一挂锁探针、第二挂锁探针、第二引物和分子信标探针的核苷酸序列依次如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seqid no.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括以下组分中至少一种：dna连接酶、dna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲液。
4.一种采用权利要求1～3任一项所述的组合物构建基于分支rca检测mirna21的荧光传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)、(b)和(c)中，孵育温度均为32～42℃，
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，还包括步骤(d)：检测所述分支滚环扩增荧光检测体系的荧光信号，根据检测得到的荧光信号判断所述待测样本中是否存在靶标mirna21或所述待测样本是否为mirna21。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：当所述待测样本中存在靶标mirna21或所述待测样本为mirna21，且所述第二分子信标探针识别到所述分支滚环扩增产物时，所述第二分子信标探针会被打开而恢复被淬灭的荧光信号。
8.一种根据权利要求4～7任一项所述的方法构建得到的基于分支rca检测mirna21的荧光传感器。
9.一种非疾病诊断或治疗目的的基于分支rca检测mirna21的方法，其特征在于：采用权利要求1～3任一项所述的组合物和/或权利要求8所述的荧光传感器。
10.根据权利要求1～3任一项所述的组合物和/或根据权利要求4～7任一项所述的构建荧光传感器的方法和/或根据权利要求8所述的荧光传感器在制备mirna21检测试剂中的应用。
