本发明属于微生物，具体涉及一种高效固氮调酸同步砷甲基化功能的复合菌剂制备及其应用。
背景技术：
1、砷是一种有毒的类金属元素，广泛分布于自然界中，是世界卫生组织公认的致癌、致畸物质之一。在水体、土壤环境中以无机砷为主，包括砷酸盐(as(v))和亚砷酸盐(as(iii))，其中as(iii)是as(v)毒性的60倍，是甲基砷毒性的100倍以上。近年来，由于矿山开采、冶炼废水排放、农药残留等影响，我国土壤、水体砷污染问题越来越突出。土壤中as(v)主要吸附在铁氧化物上，湿地、稻田厌氧环境加速了铁氧化物的还原溶解，导致as(v)的释放，通过食物链砷不断向人体富集，给人类健康带来严重风险。传统的降低砷生物有效性的途径为厌氧条件下促进as(iii)氧化成as(v)，这种方法在一定程度上可以降低砷的移动性，但是仍然没有缓解砷的毒性，没有降低无机砷的比例。针对这一技术瓶颈，提出一种新的调控策略：促进砷的还原及甲基化，同时促进有机砷的挥发从而降低总砷和无机砷含量。因此，如何促进as(v)的还原、as(iii)的甲基化是本领域的主要研究难点。
2、与此同时，砷污染稻田往往伴随着土壤酸化、地力低下等生产障碍问题，显著影响我国耕地的生产力。在调控砷的迁移过程中，能够同时改善土壤酸化，解决地力障碍问题，对实现高效可持续的土壤改良和治理具有重要意义。
3、微生物固氮技术可提高土壤的氮养分，减少化肥的输入，改善土壤质量。梭菌等微生物利用空气中的n2在固氮酶的作用下转化生成nh3(反应式1)，该固氮反应同时也是一个放氢反应，固氮关键酶为[mo-fe]，产氢关键酶有[fe-fe]、[ni-fe]和[fe]氢酶。微生物通过这些酶的电子传递作用还原质子产氢。这些酶的活性中心为金属离子，因此添加铁矿物有利于固氮产氢。另外天然的有机质木本泥炭、生物炭等材料可以作为电子穿梭体促进电子的传递，也有助于固氮产氢。甲硫氨酸是一种甲基供体，利用甲硫氨酸改性的复合木本泥炭作为菌剂的载体，有利于菌剂的定植，并促进砷的还原、甲基化，以及同步促进菌剂的固氮产氢过程，有望解决稻田、湿地环境砷污染风险管控以及耕地地力提升等难题。
4、n2+8h++8e-+16atp→2nh3+h2+16adp+16pi (1)
5、针对上述问题，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明第一方面的目的，在于提供一种微生物组合。
2、本发明第二方面的目的，在于提供一种复合菌剂。
3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第二方面的复合菌剂的制备方法。
4、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的微生物组合、本发明第二方面的复合菌剂的应用。
5、本发明第五方面的目的，在于提供一种方法。
6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
7、本发明的第一个方面，提供一种微生物组合，包括解苯甲酸副梭菌(paraclostridium benzoelyticum)yh01和生孢梭菌(clostridium sporogenes)lha6；其中解苯甲酸副梭菌yh01的分类学名称为paraclostridium benzoelyticum，于2024年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmcc no:64705。
8、本发明的第二个方面，提供一种复合菌剂，包括本发明第一方面的微生物组合、本发明第一方面的微生物组合的培养物、本发明第一方面的微生物组合的培养上清液或本发明第一方面的微生物组合的提取物中的至少一种。
9、上述菌剂的活性成分可为上述解苯甲酸副梭菌yh01和生孢梭菌lha6、上述解苯甲酸副梭菌yh01和生孢梭菌lha6的培养物(如发酵产物)，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
10、术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质，发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。
11、上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为领域(如微生物、农业)内常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
12、将复合菌剂置于含有无机五价砷的环境中厌氧培养，同步实现固氮、产氢和砷甲基化功能，可应用在酸性土壤改良、耕地肥力提升，以及砷污染稻田、湿地环境的修复。
13、在本发明一些实施方式中，所述载体包括木本泥炭。
14、在本发明一些实施方式中，所述木本泥炭为甲硫氨酸改性木本泥炭。
15、在本发明一些实施方式中，所述甲硫氨酸改性木本泥炭由包括以下方法制备得到：木本泥炭原料烘干后，粉碎过70～90目筛，将过筛的木本泥炭装入200～300目的网袋中，放置于1～2mm甲硫氨酸溶液中浸泡吸附4～8h，优选地吸附6h，取出晾干，即得到甲硫氨酸改性木本泥炭。
16、在本发明一些实施方式中，所述复合菌剂还包括细胞固定化包埋材料和胶粘剂。
17、在本发明一些实施方式中，所述细胞固定化包埋材料包括海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶、壳聚糖、海藻酸钾、聚乙烯醇、几丁质、琼脂中的至少一种。
18、在本发明一些优选实施方式中，所述细胞固定化材料为海藻酸钠。
19、在本发明一些优选实施方式中二价及以上的金属离子cu2+、fe3+、ca2+和zn2+盐溶液中的至少一种，如氯化钙。
20、在本发明一些实施方式中，所述复合菌剂为球形颗粒，直径为2～3mm。
21、本发明提供的复合菌剂主要包含具有固氮产氢同步砷还原的解苯甲酸副梭菌、具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌，两种菌株协同共生，将两种菌株共发酵后定植到甲硫氨酸复合木本泥炭上，并与细胞固定化材料(如海藻酸钠)混合、交联反应，对进行细胞固定包埋制成固氮产氢砷甲基化功能的凝胶菌球复合菌剂。其中，解苯甲酸副梭菌胞内还原as(v)并外排的as(iii)可充当具有砷甲基化功能的生孢梭菌的反应底物，促进无机砷的甲基化过程，从而降低砷的生物有效性和生物毒性。另外，解苯甲酸副梭菌还具有固氮作用，可增加稻田、湿地环境的氮含量，并且可以利用质子同步产氢，缓解土壤酸化的同时产生氢能源，在酸性土壤改良、砷污染稻田和湿地环境修复治理方面有潜在的应用价值。
22、本发明的第三个方面，提供本发明第二方面的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
23、将本发明第一方面的微生物组合接种至含有木本泥炭的培养基中定植培养，得到复合菌液；
24、将复合菌液与细胞固定化材料混合，滴加至交联剂溶液中，交联反应，得到复合菌剂。
25、在本发明一些实施方式中，所述培养基为tsb培养基，其主要配方为胰蛋白胨16～18g/l，大豆蛋白胨2～4g/l，氯化钠4～6g/l，磷酸二氢钾2～3g/l，葡萄糖2～3g/l，余量为水，ph值6.5～7.2；优选为：胰蛋白胨17g/l，大豆蛋白胨3g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾2.5g/l，葡萄糖2.5g/l，余量为水，ph值7.0±0.2。
26、在本发明一些实施方式中，所述定植培养的条件为28-35℃培养20～30h；优选为30℃培养24h。
27、在本发明一些实施方式中，所述定植培养为厌氧培养。
28、在本发明一些实施方式中，所述培养基中，解苯甲酸副梭菌yh01和生孢梭菌lha6的接种量为1％～3％，优选地，接种量为2％。
29、在本发明一些实施方式中，所述细胞固定化包埋材料为质量分数为2％～5％的海藻酸钠溶液；优选为3％的海藻酸钠溶液。
30、在本发明一些实施方式中，所述复合菌液与细胞固定化包埋材料的体积比为1:1～2。
31、在本发明一些实施方式中，所述交联剂溶液为质量分数为1％～5％的氯化钙溶液；优选为2％的氯化钙溶液。
32、在本发明一些实施方式中，所述交联反应的时间为4～10h；优选为4～8h。
33、在本发明一些实施方式中，所述滴加的过程中进行搅拌，转速为3～10ml/min，优选地，转速为5～7ml/min。
34、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的微生物组合、本发明第二方面的复合菌剂在(1)～(15)中至少一种中的应用：
35、(1)还原砷；
36、(2)制备还原砷的产品；
37、(3)产氢；
38、(4)制备产氢的产品；
39、(5)固氮；
40、(6)制备固氮的产品；
41、(7)砷的甲基化；
42、(8)制备砷甲基化的产品；
43、(9)污染环境修复；
44、(10)制备砷污染环境修复的产品；
45、(11)制备土壤改良剂；
46、(12)降低植物无机砷的含量；
47、(13)制备降低植物无机砷的含量的产品；
48、(14)提高耕地肥力；
49、(15)制备提高耕地肥力的产品。
50、在本发明一些实施方式中，(9)～(10)中所述的环境为砷污染环境。
51、在本发明一些实施方式中，所述砷包括无机五价砷或无机三价砷。
52、在本发明一些实施方式中，所述无机五价砷为砷酸或砷酸盐，所述无机三价砷为亚砷酸或亚砷酸盐。
53、在本发明一些实施方式中，所述五价砷或三价砷的浓度为：0～3mmol/l。
54、在本发明一些实施方式中，所述环境包括但不限于水体、土壤、湿地、沉积物。
55、在本发明一些实施方式中，所述还原砷的还原产物为as(iii)，如亚砷酸或亚砷酸盐。
56、在本发明一些实施方式中，所述砷甲基化为将无机砷转化为一甲基(mma)、二甲基(dma)和/或三甲基(tma)。
57、在本发明一些实施方式中，所述固氮是将氮气转化为自身、共生菌株、作物所需要的无机氮源nh4+。
58、在本发明一些实施方式中，所述产氢是指可利用环境中的质子产生氢气，缓解土壤、水体、湿地酸化。
59、在本发明一些实施方式中，所述植物包括农作物，如水稻、白菜等。
60、本发明的第五个方面，提供一种方法，包括使用本发明第一方面的微生物组合、本发明第二方面的复合菌剂处理待处理样品即可；
61、所述方法包括a1)～a7)中至少一种：
62、a1)一种还原砷的方法；
63、a2)一种产氢的方法；
64、a3)一种固氮的方法；
65、a4)一种砷甲基化的方法；
66、a5)一种污染环境修复的方法；
67、a6)一种降低植物无机砷的含量的方法；
68、a7)一种提高耕地肥力的方法。
69、在本发明一些实施方式中，所述待处理样品包括但不限于砷污染水、砷污染土壤、植物、无机五价砷、无机三价砷等等。
70、本发明的有益效果是：
71、本发明提供的微生物组合可以互营共生，既能厌氧砷甲基化、又能加速吸附态、结合态砷的还原溶解、源源不断地为砷甲基化过程提供as(iii)底物，提高砷的甲基化效率，降低环境中砷的毒性。同时可高效生成清洁能源h2，可用于新能源的开发与应用，在土壤地力提升、新能源h2生产、提高土壤ph以及砷污染土壤(如砷污染稻田、湿地环境)修复方面具有较大的应用潜力。
72、本发明提供的复合菌剂可有效消耗土壤质子产氢、缓解土壤酸化，并且通过固氮产氨提高土壤肥力和产能。用于土壤修复方面可有效提高氮素养分，可减少一定比例的化肥施用量。同时，可有效补充土壤、污水或者污泥中砷污染修复过程的能耗及碳排放，在碳中和砷污染修复方面具有应用潜力。
73、具体地，解苯甲酸副梭菌在土壤固氮的同时消耗介质中的质子产生氢气，从而有效增加土壤的无机氮并缓解土壤酸化，相比石灰、生物炭等碱性物料治理土壤酸化技术，该技术能耗低、人工撒施成本低，且具有长效性并能持续增加土壤肥力，该菌一旦在土壤中定植，可有效固氮降酸；该菌株有强的砷还原能力和砷耐受性，在快速还原as(v)的同时并将as(iii)外排，与以as(iii)为底物的砷甲基化生孢梭菌协同生长，并且可以高效固氮为生孢梭菌提供氮素，提高其砷甲基化效率，二者互营共生，有效降低了土壤和农产品的砷污染风险。
74、木本泥炭是一种天然的有机质，主要成分为腐殖质，其具有大量的活性官能团，如羧基、醇羟基和酚羟基等，因而具有很高的反应活性进而影响污染物的迁移转化过程。木本泥炭含有一定的磷、钾元素和有机碳，是一种天然的有机肥料，输入农田可改善农田的肥力状况。
75、甲硫氨酸是一种有效的甲基供体，可以有效促进砷的甲基化反应，将其与木本泥炭复合后作为菌株的载体，可增加菌株的生态位点，提高菌株的负载量。由此制备的复合菌剂可有效调控砷的甲基化过程，降低土壤和农产品中无机砷的比例，实现了农产品砷污染风险调控，同时高效降酸，提高土壤ph、增加土壤有机质和氮养分含量。
1.一种微生物组合，包括解苯甲酸副梭菌(paraclostridium benzoelyticum)yh01和生孢梭菌(clostridium sporogenes)lha6；其中解苯甲酸副梭菌yh01的分类学名称为paraclostridium benzoelyticum，于2024年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmcc no:64705。
2.一种复合菌剂，包括权利要求1所述微生物组合、权利要求1所述微生物组合的培养物、权利要求1所述微生物组合的培养上清液或权利要求1所述微生物组合的提取物中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂还包括载体，所述载体包括木本泥炭；
4.根据权利要求3所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂还包括细胞固定化包埋材料和交联剂；
5.权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述交联反应的时间为4～10h。
7.权利要求1所述的微生物组合、权利要求2～4中任一项所述的复合菌剂在(1)～(15)中至少一种中的应用：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，(9)～(10)中所述的环境为砷污染环境。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述砷包括无机五价砷或无机三价砷。
10.一种方法，包括使用权利要求1所述微生物组合、权利要求2～4中任一项所述的复合菌剂处理待处理样品即可；
