本发明属于分子生物学，具体涉及一种ssr分子标记组合及其引物对与其在黄连木性别鉴定中的应用。
背景技术：
1、中国黄连木(pistacia chinensis bunge)属漆树科(anacardiaceae)黄连木属(pistacia)落叶乔木，是集生物能源、用材、蔬菜、观赏、药用于一体的优良多功能树种，其果实出油率高可达到53.8％，在生物能源方面起重要作用。中国黄连木多为雌雄异株，其结实产量的提升与雌雄株早期种植配比关系密切，而在幼苗时期，不同性别的黄连木在形态上十分相似，且黄连木实生苗童期长达5～7年，在其开花之前难以准确有效地在形态和生理水平进行性别鉴定，也是制约黄连木育种改良效率提升的瓶颈。前期在黄连木属已有不少研究对性别鉴定的引物进行了筛选，然而，大量实践表明仍存在遗漏和错报的个体，无法100％鉴定雌雄性别。因此，开发一套应用于黄连木幼苗期的高效稳定的雌雄鉴定体系，具有重要的生产及科研价值和巨大的经济效益。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种ssr分子标记组合及其引物对与其在黄连木性别鉴定中的应用，解决现有技术难以准确有效地在形态和生理水平进行性别鉴定的问题，所述ssr引物鉴定中国黄连木性别的准确率高、扩增结果重复性好、稳定性强，能够高效应用于中国黄连木早期性别鉴定的研究。
2、本发明的实现过程如下：
3、一种ssr分子标记组合，包括ssr分子标记pos4-623、ssr分子标记pos4-645和ssr分子标记pos4-858。
4、进一步，所述ssr分子标记pos4-623的引物对分别为正向引物序列seq idno:1和反向引物序列seq id no:2；
5、所述ssr分子标记pos4-645的引物对分别为正向引物序列seq id no:3和反向引物序列seq id no:4；
6、所述ssr分子标记pos4-858的引物对分别为正向引物序列seq id no:5和反向引物序列seq id no:6。
7、上述ssr分子标记组合在黄连木性别鉴定中的应用。
8、上述ssr分子标记组合在黄连木性别相关的辅助育种或选育中的应用。
9、进一步，包含上述ssr分子标记组合的检测试剂或试剂盒。
10、上述ssr分子标记组合鉴定黄连木性别的方法，包括以下步骤：
11、(1)提取待测黄连木的基因组dna
12、选取黄连木的幼嫩叶片经研磨后，使用dna secure试剂盒的离心吸附柱法提取黄连木基因组dna；
13、(2)ssr位点识别及引物设计
14、以黄连木雌、雄株为研究对象，通过ssrmmd程序对比黄连木雌、雄基因组的候选性别决定区域进行差异ssr位点挖掘，进一步挖掘多态ssr；同时，针对多态位点设计引物对，合成引物；
15、(3)pcr扩增反应体系
16、以步骤(1)中提取的黄连木基因组dna为模板，对步骤(2)中合成的引物进行筛选，分别利用ssr分子标记pos4-623、ssr分子标记pos4-645和ssr分子标记pos4-858三组引物对进行pcr扩增；其中，所述ssr分子标记pos4-623的引物对是正向引物序列seq id no:1和反向引物序列seq id no:2；ssr分子标记pos4-645的引物对是正向引物序列seq id no:3和反向引物序列seq id no:4；ssr分子标记pos4-858的引物对是正向引物序列seq id no:5和反向引物序列seq id no:6；
17、(4)pcr扩增反应产物检测
18、对扩增产物使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，当ssr分子标记pos4-623、ssr分子标记pos4-645和ssr分子标记pos4-858三组引物对所对应的扩增产物分别出现151bp、138bp、128bp大小的一条雌性特异性特征条带时，则待测黄连木为雌株；
19、当ssr分子标记pos4-623、ssr分子标记pos4-645和ssr分子标记pos4-858三组引物对中至少出现一组引物对所对应的扩增产物未出现特征条带，则待测中国黄连木为雄株。
20、进一步，步骤(3)中，模板浓度为30ng/μl。
21、进一步，步骤(3)中，pcr扩增反应体系为2×taq master mix 10.0μl、10μmol/l正向引物0.5μl、10μmol/l反向引物0.5μl、30ng/μl基因组dna 1.0μl以及ddh2o 8.0μl。
22、进一步，步骤(3)中，pcr扩增反应程序为94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，最佳退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟，4℃保存。
23、进一步，步骤(4)中，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时所用的凝胶为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶。
24、相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
25、本发明基于首次组装的高质量中国黄连木雌株、雄株基因组，通过对比黄连木雌、雄株基因组，将其候选性别特异区域划分为pos1、pos2、pos3和pos4四部分，其中pos4区域位于雌染色体约46.8mbp～55.2mbp、雄染色体约42.0mbp～49.1mbp的位置，使用ssrmmd程序对该区域开发性别特异ssr分子标记并设计引物对，筛选出三对中国黄连木雌性特异性ssr分子标记(pos4-623、pos4-645和pos4-858)；利用40份性别确定的中国黄连木对上述三对引物组合进行验证，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法分离pcr扩增产物，根据扩增条带可直观地确定中国黄连木性别。验证结果显示，三对ssr分子标记引物组合能够将上述40份中国黄连木的性别区分开，可扩增出中国黄连木雌性特异性条带，大小分别为151bp、138bp、128bp。三对引物组合分别在特异条带大小处有一条带的为雌性植株，没有上述条带的为雄性植株。利用本发明开发的pos4-623、pos4-645和pos4-858三对ssr引物组合鉴定中国黄连木性别的准确率高达95.0％，且操作简便、成本低、鉴定效率高和通用性好，能够实现中国黄连木早期的性别鉴定。
1.一种ssr分子标记组合，其特征在于：包括ssr分子标记pos4-623、ssr分子标记pos4-645和ssr分子标记pos4-858。
2.根据权利要求1所述ssr分子标记组合，其特征在于：所述ssr分子标记pos4-623的引物对分别为正向引物序列seq id no:1和反向引物序列seq id no:2；
3.权利要求1或2所述ssr分子标记组合在黄连木性别鉴定中的应用。
4.权利要求1或2所述ssr分子标记组合在黄连木性别相关的辅助育种或选育中的应用。
5.包含权利要求1或2所述ssr分子标记组合的检测试剂或试剂盒。
6.利用权利要求1或2所述ssr分子标记组合鉴定黄连木性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述ssr分子标记组合鉴定黄连木性别的方法，其特征在于：步骤(3)中，模板浓度为30ng/μl。
8.根据权利要求6所述ssr分子标记组合鉴定黄连木性别的方法，其特征在于：步骤(3)中，pcr扩增反应体系为2×taq master mix 10.0μl、10μmol/l正向引物0.5μl、10μmol/l反向引物0.5μl、30ng/μl基因组dna 1.0μl以及ddh2o 8.0μl。
9.根据权利要求6所述ssr分子标记组合鉴定黄连木性别的方法，其特征在于：步骤(3)中，pcr扩增反应程序为94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，最佳退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟，4℃保存。
10.根据权利要求6所述ssr分子标记组合鉴定黄连木性别的方法，其特征在于：步骤(4)中，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时所用的凝胶为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶。
