本发明属于具体涉及一种循环胎儿细胞的动态异源多价富集捕获方法。
背景技术：
1、据统计，我国出生缺陷的总发生率约为5.6％，且各地出生缺陷发生率呈现逐年增高的趋势。有效控制和预防出生缺陷，利用科学手段保障孕妇顺利生育健康胎儿，已成为亟需解决的民生问题。其中，"产前筛查和诊断"是预防出生缺陷中最为重要的手段之一。
2、产前检测指的是在出生前利用影像学或遗传学方法，对胚胎或胎儿的发育状态进行检测和诊断，以及评估其是否患有遗传性疾病。监测并提早干预可能的遗传性疾病或与染色体异常相关的疾病至关重要。目前，对于像唐氏综合症这样的严重染色体异常性疾病，由于缺乏有效的治疗方法，主要依赖出生干预等方式进行预防。因此，进行必要的产前检测与诊断是降低新生儿出生缺陷率、提高人口素质的最有效方法。
3、在过去的四十多年里，产前检测领域取得了显著进展。从最初的利用侵入性方法获取胎儿遗传物质，对高龄产妇进行唐氏综合症检测，到后来的利用非侵入性方法对血清学标志物进行早中孕期的产前筛查，再到现在的利用非侵入性方法获得胎儿遗传信息进行早期无创产前检测。目前，基于循环胎儿细胞的产前检测方法因其非侵入性、适用于常规检查、高灵敏度、高特异性和广泛的测定范围等优势而受到广泛关注。
4、然而，由于循环胎儿细胞在母体外周血中的含量稀少，且背景干扰强，实现高效的捕获和分离存在一定难度，这成为了临床利用循环胎儿细胞进行无创产前检测所面临的最大挑战。
5、cn108535228a公开了一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法。该技术方案结合了微流控芯片的细胞分离作用和特异性亲和识别原理，实现了孕妇外周血中游离胎儿细胞(如胎儿有核红细胞、滋养层细胞等)的高效率、高纯度捕获分离。然而，该技术方案存在以下缺陷和障碍：
6、(1)捕获的胎儿细胞不能无损释放：封闭式dld芯片的通道和微柱表面修饰有抗体，通过抗体与细胞表面抗原的特异性结合来捕获胎儿细胞。由于抗体的高亲和力，一旦细胞被捕获，便难以释放，导致细胞丢失率高和细胞破损率高，无法实现细胞的无损释放。
7、(2)检出率较低：需要较大量(2-10ml)的孕妇血液样本才能捕获到足够数量的胎儿细胞。例如，最早在孕期8周时，检测2ml外周血中仅含有5个有核红细胞。这限制了对后续单细胞测序分析的基因含量，因为基因量低，难以直接进行测序分析。
技术实现思路
1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种循环胎儿细胞的动态异源多价富集捕获方法。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种循环胎儿细胞的动态异源多价富集捕获方法，包括如下步骤：
4、(1)制备微流控芯片，所述微流控芯片为鱼骨型芯片，包括上层的鱼骨结构层和下层的通道层；鱼骨结构层中设有若干间隔布置的鱼骨形横梁，通道层中设有若干均匀分布的支撑柱；支撑柱间的间隙形成流体通道；
5、(2)将表面修饰有cd71纳米抗体和cd71核酸适配体的磁珠输送入步骤(1)中的微流控芯片中，然后将该微流控芯片置于磁铁上进行稳定，使磁珠均匀稳定地分布在微流控芯片内部；
6、(3)将含有循环胎儿细胞的孕妇外周血裂红(裂解红细胞)后输送进入步骤(2)处理后的微流控芯片内，使循环胎儿细胞通过磁珠表面修饰的cd71纳米抗体和cd71核酸适配体被磁珠捕获；
7、(4)捕获完成后，撤去磁铁，接着向微流控芯片中通入释放试剂，使被捕获的循环胎儿细胞从磁珠上释放，进而实现循环胎儿细胞的捕获富集。
8、在本发明的一个优选实施方案中，所述微流控芯片的几何排布为：所述鱼骨结构层的高度为30-60μm，所述通道层的高度为30-60μm；所述鱼骨形横梁的宽度为80-120μm，高度为30-60μm，相邻的鱼骨形横梁间的间距为80-120μm；支撑柱的高度为30-60μm。
9、进一步优选的，所述微流控芯片的材质为聚二甲氧基硅烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯或聚碳酸酯中的一种或至少两种的组合；所述微流控芯片通过光刻模板、压印模板或注塑模板方法制备得到。
10、在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中，所述输送的速度为0.8-1.2ml/h。
11、在本发明的一个优选实施方案中，所述释放试剂为4％-5％的bsa。
12、在本发明的一个优选实施方案中，所述cd71纳米抗体通过生物素-链霉亲和素反应修饰于所述磁珠的表面。
13、在本发明的一个优选实施方案中，所述cd71核酸适配体通过生物素-链霉亲和素反应修饰于所述磁珠的表面。
14、在本发明的一个优选实施方案中，所述cd71纳米抗体和cd71核酸适配体均通过生物素-链霉亲和素反应修饰于所述磁珠的表面。
15、本发明的有益效果是：
16、1、本发明实现了对胎儿细胞的无损释放，通过使用一种简单的动态芯片技术，可以高效地获得单细胞靶细胞，这些细胞随后可用于下游分析。这一过程最终能够实现精准的产前诊断，为孕妇和医生提供重要的遗传信息。
17、2、本发明利用多价效应原理，实现了对胎儿细胞的快速识别和高亲和性捕获。与现有技术相比，本发明仅需1ml孕妇血液样本，就能有效地捕获胎儿细胞，达到现有技术中需要2ml及以上样本量才能获得的计数结果。这不仅降低了孕妇血液样本的需求量，还提高了检出率。事实上，本发明能够在孕期最早7周时，通过检测1ml外周血中是否含有至少4个有核红细胞，从而实现对胎儿状况的早期监测。
1.一种循环胎儿细胞的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述微流控芯片的几何排布为：所述鱼骨结构层的高度为30-60μm，所述通道层的高度为30-60μm；所述鱼骨形横梁的宽度为80-120μm，高度为30-60μm，相邻的鱼骨形横梁间的间距为80-120μm；支撑柱的高度为30-60μm。
3.如权利要求2所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述微流控芯片的材质为聚二甲氧基硅烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯或聚碳酸酯中的一种或至少两种的组合；所述微流控芯片通过光刻模板、压印模板或注塑模板方法制备得到。
4.如权利要求1所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述输送的速度为0.8-1.2ml/h。
5.如权利要求1所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述释放试剂为4％-5％的bsa。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述cd71纳米抗体通过生物素-链霉亲和素反应修饰于所述磁珠的表面。
7.如权利要求1至5中任一权利要求所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述cd71核酸适配体通过生物素-链霉亲和素反应修饰于所述磁珠的表面。
8.如权利要求1至5中任一权利要求所述的动态异源多价富集捕获方法，其特征在于：所述cd71纳米抗体和cd71核酸适配体均通过生物素-链霉亲和素反应修饰于所述磁珠的表面。
