本公开涉及使用多种t细胞受体对干细胞进行工程化的方法。
背景技术：
1、t细胞的体外产生和扩增可用于广泛的临床应用，包含癌症治疗。例如，临床数据显示，具有肿瘤抗原特异性受体的经工程化的t细胞在一些患者中对于引起转移性癌症的消退是有用的。不幸的是，并非所有患者都能从此类治疗中受益。一种解释是在体外扩增期间，一些t细胞变得耗尽或衰老，这限制了治疗功效和体内持久性。
技术实现思路
1、本公开提供了用于快速且有效地产生具有至少两种不同的t细胞受体(tcr)和/或嵌合抗原受体(car)的大量t细胞的系统和方法。通过产生具有多种不同的tcr的t细胞(多tcr t细胞)，本发明的方法能够产生识别多种不同的抗原的t细胞，由此提高其作为治疗性治疗的功效。类似地，本发明提供了用于产生共同表达不同的tcr或tcr和car的t细胞的方法，其为细胞提供了赋予特定癌症细胞靶向特性的最佳表型。
2、在具体实施例中，本公开提供了从干细胞，例如造血干细胞(hsc)制备多tcr t细胞的方法。通过从hsc开始，本发明的系统和方法在制备本发明的t细胞中利用干细胞的自我再生和细胞分化能力。
3、在本发明的方法中使用干细胞(例如，hsc)的优点包含这些干细胞的再生和扩增的能力。同种异体细胞疗法通常需要数十亿个细胞用于单剂量的治疗。由于干细胞潜在的无限扩增能力，本发明的方法非常适于大规模产生高质量细胞产物并且使那些产物可快速地用于治疗。此外，干细胞的标志是其分化为不同细胞类型的能力。在本公开的上下文中，分化能力提供了可以产生各种t细胞亚型(包含例如自然杀伤t细胞、αβt细胞、γδt细胞等)的细胞制备平台。
4、在某些方面，本发明的方法包含通过引入编码至少第一tcr的转基因从hsc产生经工程化的t细胞。hsc分化为表达tcr的t细胞。分化后，可以使t细胞经受一个或多个选择、成熟、扩增和/或冷冻保存步骤。在这些上述步骤中的任一个之前或之后，可以将一种或多种不同的tcr/car引入到t细胞(例如，通过引入转基因)中，由此产生具有多种不同的tcr和/或tcr和car的经工程化的t细胞。
5、将期望的tcr/car添加到源自hsc的t细胞的能力将若干优点赋予本发明的方法。例如，在本发明的某些方法中，hsc分化为t细胞。这些t细胞可以成熟、选择、扩增和/或冷冻保存。通常，此过程的步骤总共需要约2-4周。使用本发明的方法，可以在t细胞分化后；以及任选地在其选择、成熟、扩增和/或冷冻保存之后将一种或多种另外的tcr/car引入到t细胞中。
6、在分化后添加另外的tcr允许t细胞从本身源自hsc的现成经工程化的t细胞开始，用靶向病理学(例如，癌症)独特抗原的受体进行工程化。这可以减少产生具有期望的tcr和/或car的组合的t细胞所需的前导时间，因为可以在用于产生单个受体t细胞的2-4周时段之后添加另外的受体。
7、另外，通过在初始tcr之后添加另外的tcr或car，本发明的方法可以避免由于在表达多种不同的引入的受体的同时长时间培养而引起的t细胞转录和表型变化的风险。此外，通过使分化的t细胞准备好接受另外的，本发明的方法提供了更大的灵活性来产生具有最小tcr错配的多tcr t细胞。tcr错配是一种内源性或引入的tcr的α链或β链与另一个引入的tcr的α链或β链不正确配对的现象。例如，这导致引入的tcr的表面表达减少。通过使用本发明的方法，可以对第一引入的tcr进行工程化，使其与第二引入的tcr错配的可能性降低，例如通过使用修饰，如鼠类恒定结构域、二硫键桥等。可替代地或另外，第一引入的tcr可以是γδ(gamma delta)tcr，而第二个是αβ(alpha beta)，这同样降低了错配的可能性。
8、因此，本发明提供了一种用于产生同种异体、现成的、非hla限制性nkt或γδt细胞的平台，其可以冷冻保存并随后解冻以供使用。然后可以以患者特异性方式，例如通过引入靶向特定病理学的car或tcr来对这些细胞进行进一步工程化。因此，本发明的干细胞培养物和组合物可以用于治疗跨越各种病理学的数千名不同患者。
9、本发明提供了用于产生经工程化的t细胞的方法。示例性方法包含进行使造血干细胞(hsc)体外分化以产生包括不是hla限制性的第一t细胞受体(tcr)的同种异体γδ(gamma delta)t细胞或恒定型自然杀伤t(inkt)细胞的过程。该方法进一步包含：将至少第二tcr引入到γδt细胞或inkt细胞中以产生具有两个不同tcr的t细胞。在某些方面，第二或另外的tcr可以是hla限制性的或患者特异性的。
10、在某些方面，该方法还包含在将至少第二tcr引入到γδt细胞或inkt细胞中后使t细胞成熟。
11、在本发明的一些方法中，hsc分化为γδt细胞。在某些方面，第二tcr是αβ(alphabeta)tcr。在本发明的一些方法中，hsc分化为inkt。在某些方面，第二tcr是αβ(alphabeta)tcr。
12、在某些方法中，体外分化步骤包含将一种或多种编码第一t细胞受体的核酸引入到hsc中。引入第二tcr可以包含将一种或多种编码第二t细胞受体的核酸引入到γδt细胞或inkt细胞中。
13、体外分化步骤可以进一步包含引入一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码嵌合抗原受体(car)和一种或多种转基因中的至少一种。在某些方面，至少一种或多种转基因包含以下中的至少一种，以使t细胞更有效或更不易于耗尽或排斥：细胞因子、检查点抑制剂、转化生长因子β信号传导抑制剂、细胞因子释放综合征抑制剂、神经毒性抑制剂或其它有效载荷。
14、在本发明的某些方法中，第一和/或第二tcr是经工程化的tcr。在某些方面，第一tcr是经工程化的tcr。在某些方面，第二tcr是经工程化的tcr。根据本发明的经工程化的tcr可以包含一个或多个修饰，以防止第一tcr与第二tcr之间的tcr错配。示例性修饰包含以下中的一种或多种：鼠类恒定结构域、二硫键桥和其它二聚化结构域。
15、在某些方法中，hsc源自祖细胞，如多能干细胞。因此，体外过程可以进一步包含对hsc或祖细胞进行基因编辑，以使t细胞更有效或更不易于耗尽或排斥。
16、在示例性方法中，第二tcr针对癌症种系抗原、病毒抗原或肿瘤特异性新抗原。
17、在某些方面，引入至少第二tcr的步骤包含引入多种不同的tcr。每种不同的tcr可以针对不同的肿瘤特异性新抗原。新抗原反应性tcr可以来自或源自外周血t细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞。
18、在某些示例性方法中，引入第二tcr的该步骤包括通过逆转录病毒转导、慢病毒转导或核苷酸转移的非病毒方法将一种或多种核酸插入到γδt细胞或inkt细胞中。
19、在某些方面，该方法进一步包含使用装载有由第二tcr识别的肽的hla匹配的或部分匹配的pbmc体外激活和扩增t细胞。
20、当前公开的发明还提供了使用本发明的多tcr细胞的治疗方法。示例性治疗方法包含获得hsc并进行hsc体外分化为γδt细胞或inkt细胞的过程，其中分化的t细胞包含第一tcr。该方法还可以包含将至少第二tcr引入到γδt细胞或inkt细胞中，并且使所得t细胞成熟以产生具有两种不同的功能tcr的t细胞。然后，该方法包含将t细胞引入到受试者体内，其中至少第二tcr针对在受试者的细胞的表面上表达的疾病相关抗原。
21、在某些方面，hsc来自或源自受试者。
22、在示例性方法中，该方法进一步包含在进行体外分化步骤后，获得指定一种或多种靶向疾病相关抗原的tcr的数据，并且随后进行引入至少第二tcr的步骤。
1.一种产生t细胞的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在将所述至少第二tcr引入到所述gd t细胞或所述inkt细胞后使所述t细胞扩增。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述hsc分化为gd t细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二tcr是αβ(ab)tcr。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述hsc分化为inkt。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二tcr是αβ(ab)tcr。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外分化步骤包括将一种或多种编码所述第一t细胞受体的核酸引入到所述hsc中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中引入所述第二tcr包括将一种或多种编码所述第二t细胞受体的核酸引入到所述gd t细胞或所述inkt细胞中。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述体外分化步骤进一步包括引入一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码嵌合抗原受体(car)和一种或多种转基因中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种或多种转基因包括以下中的至少一种，以使所述t细胞更有效或更不易于耗尽或排斥：细胞因子、检查点抑制剂、转化生长因子β信号传导抑制剂、细胞因子释放综合征抑制剂、神经毒性抑制剂或其它有效载荷。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一tcr和/或所述第二tcr是经工程化的tcr。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述经工程化的tcr包括一种或多种修饰，以防止所述第一tcr与所述第二tcr之间的tcr错配。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述修饰包含以下中的一种或多种：鼠类恒定结构域、二硫键桥和其它二聚化结构域。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述hsc源自祖细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述祖细胞是多能干细胞。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述体外过程进一步包括对所述hsc或所述祖细胞进行基因编辑，以使所述t细胞更有效或更不易于耗尽或排斥。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二tcr针对癌症种系抗原、病毒抗原或肿瘤特异性新抗原。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入至少第二tcr的步骤包括引入多种不同的tcr。
19.根据权利要求18所述的方法，其中每种不同的tcr针对不同的肿瘤特异性新抗原。
20.根据权利要求19所述的方法，其中新抗原反应性tcr来自或源自外周血t细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入所述第二tcr的步骤包括通过逆转录病毒转导、慢病毒转导或核苷酸转移的非病毒方法将一种或多种核酸插入到所述gd t细胞或所述inkt细胞中。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使用装载有由所述第二tcr识别的肽的hla匹配的或部分匹配的pbmc体外激活和扩增所述t细胞。
23.一种治疗方法，所述方法包括：
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述hsc来自或源自所述受试者。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述hsc是同种异体hsc。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法进一步包括在进行所述体外分化步骤后，获得指定一种或多种靶向所述疾病相关抗原的tcr的数据，并且随后进行所述引入所述至少第二tcr的步骤。
