本发明涉及一种用于培养细胞的组合物,特别涉及一种试剂作为动物源性血清的替代,制成培养基,用于间充质干细胞的培养。
背景技术:
1、脐带间充质干细胞因其自我更新、多向分化潜能等特性,被认为是再生医学领域的重要种子细胞。目前应用脐带间充质干细胞治疗包括急性肾损伤、失眠症、老年衰弱、膝骨关节炎等诸多疾病已经广泛进入临床试验或探索性临床试验中。目前开展的脐带间充质干细胞生产体系中含有胎牛血清,是一种动物源性成分,使用该体系生产的脐带间充质干细胞发生异种蛋白免疫反应,人畜共患病原体等风险较高。
2、发明专利201410018678.2和201611167180.8均对间充质干细胞的无血清培养和扩增进行了探索,并取得了良好的结果。为了开发更高标准的临床级脐带间充质干细胞,可有效支持细胞生产,寻求更多的解决方案,满足临床级脐带间充质干细胞生产需求,尤其是安全地制取细胞显得仍有必要。
技术实现思路
1、本发明的一个目的在于提供一种试剂,作为动物源性血清,比如:胎牛血清的替换,以满足间充质干细胞的培养和扩增需求。
2、本发明的另一个目的在于提供一种用于间充质干细胞的无血清培养基,培养和扩增间充质干细胞。
3、一种试剂,用于间充质干细胞的培养和/或扩增,包括
4、第一组分,其为间充质干细胞基础培养剂,比如:必须氨基酸、碳水化合物和微量元素。具体的物质和含量包括:
5、二水合氯化钙265mg/ml、九水合硝酸铁0.1mg/ml、氯化钾400mg/ml、无水硫酸镁97.67mg/ml、氯化钠6400mg/ml、无水磷酸二氢钠109mg/ml、丁二酸75mg/ml、丁二酸钠100mg/ml、l-盐酸精氨酸84mg/ml、l-盐酸胱氨酸63mg/ml、甘氨酸30mg/ml、l-盐酸组氨酸42mg/ml、l-异亮氨酸105mg/ml、l-亮氨酸105mg/ml、l-盐酸赖氨酸146mg/ml、l-甲硫氨酸30mg/ml、l-苯丙氨酸66mg/ml、l-丝氨酸42mg/ml、l-苏氨酸95mg/ml、l-色氨酸16mg/ml、l-酪氨酸72mg/ml、l-缬氨酸94mg/ml、d-泛酸钙4mg/ml、酒石酸胆碱7.2mg/ml、叶酸4mg/ml、肌醇7.2mg/ml、烟酰胺4mg/ml、核黄素0.4mg/ml、盐酸硫胺4mg/ml、盐酸吡哆辛4mg/ml、葡萄糖1000mg/ml、丙酮酸钠110mg/ml、酚红9.3mg/ml、l-谷氨酰胺0.584mg/ml。
6、第二组分,主要包括脐带血血小板裂解液,还含有重组人血清白蛋白4mg/ml、海藻糖0.2mg/ml和白藜芦醇4.6mg/ml;
7、第三组分,其包括:
8、人重组凝血酶磁珠10000珠/ml。
9、一种用于间充质干细胞的无血清培养基,包括
10、第一组分和第二组分,按体积比,第二组分∶第一组分为5%~20%;
11、第一组分,其为间充质干细胞基础培养剂,比如:必须氨基酸、碳水化合物和微量元素。具体的物质和含量包括:
12、二水合氯化钙265mg/ml、九水合硝酸铁0.1mg/ml、氯化钾400mg/ml、无水硫酸镁97.67mg/ml、氯化钠6400mg/ml、无水磷酸二氢钠109mg/ml、丁二酸75mg/ml、丁二酸钠100mg/ml、l-盐酸精氨酸84mg/ml、l-盐酸胱氨酸63mg/ml、甘氨酸30mg/ml、l-盐酸组氨酸42mg/ml、l-异亮氨酸105mg/ml、l-亮氨酸105mg/ml、l-盐酸赖氨酸146mg/ml、l-甲硫氨酸30mg/ml、l-苯丙氨酸66mg/ml、l-丝氨酸42mg/ml、l-苏氨酸95mg/ml、l-色氨酸16mg/ml、l-酪氨酸72mg/ml、l-缬氨酸94mg/ml、d-泛酸钙4mg/ml、酒石酸胆碱7.2mg/ml、叶酸4mg/ml、肌醇7.2mg/ml、烟酰胺4mg/ml、核黄素0.4mg/ml、盐酸硫胺4mg/ml、盐酸吡哆辛4mg/ml、葡萄糖1000mg/ml、丙酮酸钠110mg/ml、酚红9.3mg/ml、l-谷氨酰胺0.584mg/ml;
13、第二组分,主要包括脐带血血小板裂解液,还含有重组人血清白蛋白4mg/ml、海藻糖0.2mg/ml和白藜芦醇4.6mg/ml;
14、其中,以人重组凝血酶磁珠去除所含的纤维蛋白原,纤维蛋白原含量低。
15、本发明技术方案实现的有益效果:
16、本发明的试剂,包括多种组分,以去除了纤维蛋白原的脐带血血小板裂解液为主辅以其它组分,而制成无血清培养基,适用于(脐带)间充质干细胞的培养和扩增,未见明显的凝结现象。经验证,与10%fbs的培养基相比,本申请的培养基适用于间充质干细胞的培养和扩增,各项细胞标记物数据相当。此外,成骨基因、成软骨基因和成脂基因表达等细胞分化的指标均高于10%fbs组。
1.一种试剂,用于间充质干细胞的培养,其特征在于,包括:
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于所述的人重组凝血酶磁珠为10000珠/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于所述的第二组分还含有重组人血清白蛋白4mg/ml、海藻糖0.2mg/ml和白藜芦醇4.6mg/ml。
4.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于所述的第一组分包括:
5.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于制取所述的脐带血血小板裂解液的方法如下:
6.根据权利要求1所述的试剂在制取用于间充质干细胞无动物源性血清培养基中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于现将第三组分加入第二组分去除纤维蛋白原后,再与第一组分混合。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于第三组分被加入第二组分后,经磁性移出和清晰后,再次加入第三组分,并重复多次。
9.一种无血清培养基,用于间充质干细胞的培养,其特征在于包括:
10.根据权利要求9所述的无血清培养基,其特征在于所述的第二组分还含有重组人血清白蛋白4mg/ml、海藻糖0.2mg/ml和白藜芦醇4.6mg/ml。
11.根据权利要求9所述的无血清培养基,其特征在于所述的第一组分包括: