本发明涉及知柏清凉方的中药指纹图谱及其构建方法和应用，属于中药分析。
背景技术：
1、祖国医学在治疗复杂病因引发的慢性病方面具有明显优势和重要作用。知柏清凉方是临床治疗慢性肾小球肾炎蛋白尿的经验方，处方组成为：玉米须9g，黄柏6g，黄芪30g，升麻6g，黑豆30g，积雪草(别名连钱草)15g，白花蛇舌草15g，鸭跖草6g，知母6g，山药15g，车前草15g，六月雪30g，薏苡根(别名米仁根)30g，黄连5g，鹿衔草15g，蚕茧壳5g。据初步统计，以本方为基础方的临床使用患者累计超10万人次，其疗效确切，安全性良好。现有研究显示：知柏清凉方对老年慢性肾小球肾炎蛋白尿湿热证具有满意的临床疗效(详见老年医学与保健2019年第25卷第3期第306～310页)，进一步表明了本方除适用于一般慢性肾病蛋白尿人群外，其同样适用于慢性病共病的老年患者，这也是本方的特色所在，值得在临床上进一步推广应用。随着“三结合”中药注册审评证据体系的逐步完善以及中药新药研发技术的不断进步和创新能力的提升，将知柏清凉方开发成安全有效、质量稳定、应用方便的中药新药，充分发挥中医药在治疗老年慢性病方面的优势与特色，可为临床治疗方案提供更多的选择性和更佳的依从性。
2、中药的质量是保证其临床用药安全有效的前提。中药指纹图谱作为一种综合的可量化的鉴定手段，具有特征性、稳定性和重现性好等优点，可用于评价中药材、半成品以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性，对提高中药制剂整体质量控制水平具有重要意义，且已得到国际上广泛认可。
3、知柏清凉方是含有16味药材的中药大复方，具有药味多、辨证精准、疗效显著等特点。因此，其指纹图谱的构建存在多个难点，这些难点主要源于中药复方多组分的复杂性、药效机制的不明确和现有分析技术的局限性。此外，不同的复方品种之间因组方和化学成分的差异，其指纹图谱的构建不具有参考性和借鉴性，且至今还没有关于知柏清凉方的中药指纹图谱的相关报道。因此，研究知柏清凉方的中药指纹图谱对于该中药复方在临床上推广应用具有迫切性和重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供知柏清凉方的中药指纹图谱及其构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种知柏清凉方的中药指纹图谱，其具有17个共有特征峰，各特征峰与7号参照峰的相对保留时间在规定值的±5％的范围之内，且1号峰～17号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.175、0.335、0.510、0.555、0.711、0.863、1.0、1.257、1.315、1.577、1.806、2.596、3.218、3.284、3.708、3.771和3.796；其中：7号峰为4-香豆酸，8号峰为大豆苷，10号峰为异阿魏酸，13号峰为盐酸黄柏碱，17号峰为盐酸小檗碱。
4、所述的知柏清凉方的中药指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
5、a)对照品溶液的制备：分别精密称取4-香豆酸、大豆苷、异阿魏酸、盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱对照品适量，以体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液为溶剂配成的混合溶液作为对照品溶液；
6、b)供试品溶液的制备：精密称取知柏清凉方浸膏粉适量，用体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液进行超声提取，然后使提取液放冷至室温，再用体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液定容，再摇匀、离心，取上清液作为供试品溶液；
7、c)采用如下色谱条件：
8、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱柱长为250mm、内径为4.6mm、粒度为5μm；选择pda检测器，检测波长为284nm，柱温为30～40℃(优选35℃)，流速为0.9～1.1ml/min(优选1.0ml/min)，进样量为2～10μl(优选10μl)；理论板数按4-香豆酸峰计算不低于10000；
9、以每1000ml质量分数为0.2％的醋酸水溶液中含1g十二烷基磺酸钠的混合溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表所示的洗脱程序进行梯度洗脱：
10、
11、
12、对所述供试品溶液和所述对照品溶液分别进行hplc测定，即得到所述的知柏清凉方的中药指纹图谱。
13、一种实施方案，每1ml对照品溶液中含4-香豆酸14.53μg、大豆苷15.76μg、异阿魏酸16.92μg、盐酸黄柏碱35.33μg、盐酸小檗碱40.46μg。
14、一种实施方案，所述的知柏清凉方浸膏粉是由如下步骤制备得到：
15、s1)按知柏清凉方的日剂量处方：玉米须9g、黄柏6g、黄芪30g、升麻6g、黑豆30g、积雪草15g、白花蛇舌草15g、鸭跖草6g、知母6g、山药15g、车前草15g、六月雪30g、薏苡根30g、黄连5g、鹿衔草15g、蚕茧壳5g，称取一定倍量(具体倍量没有特殊限定，根据所需用量具体确定即可)的各中药饮片；
16、s2)按总饮片质量的10～12倍量加入水，进行回流提取2～3次，每次提取1～1.5小时；
17、s3)合并提取液，于60～70℃(优选70℃)减压浓缩至相对密度为1.13～1.20的浸膏；
18、s4)所得浸膏于60～70℃(优选70℃)减压干燥至含水量<3.0％，然后粉碎过80目筛。
19、一种实施方案，所述供试品溶液的制备方法如下：
20、精密称取知柏清凉方浸膏粉1g置于25ml容量瓶中，加入适量体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液进行超声提取20～40分钟(优选30分钟)，然后使提取液放冷至室温，再用体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液定容，再摇匀、离心，取上清液作为供试品溶液。
21、所述的知柏清凉方的中药指纹图谱可用于知柏清凉方相关制剂的质量检测和评价，所述相关制剂为汤剂、浸膏剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液剂中的任意一种。
22、所述质量检测和评价包括如下步骤：
23、①制剂供试品溶液的制备
24、取液体制剂(如汤剂或溶液剂)适量，加入适量体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液稀释至一定浓度，离心，取上清液作为制剂供试品溶液；或者，取固体制剂(如浸膏剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂或胶囊剂)1g置于25ml容量瓶中，加入适量体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液进行超声提取20～40分钟(优选30分钟)，然后使提取液放冷至室温，再用体积分数为50％～70％(优选60％)的甲醇水溶液定容，再摇匀、离心，取上清液作为制剂供试品溶液；
25、②采用上述相同色谱条件对制剂供试品溶液进行hplc测定，得到制剂供试品溶液的中药指纹图谱；
26、③将制剂供试品溶液的中药指纹图谱与所述知柏清凉方的中药指纹图谱进行比对，并利用相似度评价软件进行相似度评价。
27、与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
28、本发明首次构建了知柏清凉方的中药指纹图谱，能较全面的体现知柏清凉方中的17种化学成分，且各色谱峰的分离度及峰型较好，可用于知柏清凉方相关制剂的质量检测和用于评价知柏清凉方相关制剂批间生产的一致性，可作为控制生产工艺稳定、可重现的有效手段，对确保知柏清凉方临床用药的安全性和有效性具有重要价值。
1.一种知柏清凉方的中药指纹图谱，其特征在于：其具有17个共有特征峰，各特征峰与7号参照峰的相对保留时间在规定值的±5％的范围之内，且1号峰～17号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.175、0.335、0.510、0.555、0.711、0.863、1.0、1.257、1.315、1.577、1.806、2.596、3.218、3.284、3.708、3.771和3.796；其中：7号峰为4-香豆酸，8号峰为大豆苷，10号峰为异阿魏酸，13号峰为盐酸黄柏碱，17号峰为盐酸小檗碱。
2.一种权利要求1所述的知柏清凉方的中药指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤a)中，每1ml对照品溶液中含4-香豆酸14.53μg、大豆苷15.76μg、异阿魏酸16.92μg、盐酸黄柏碱35.33μg、盐酸小檗碱40.46μg。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤b)中，所述的知柏清凉方浸膏粉是由如下步骤制备得到：
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤b)中，所述供试品溶液的制备方法如下：
6.一种权利要求1所述的知柏清凉方的中药指纹图谱在知柏清凉方相关制剂的质量检测和评价中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述相关制剂为汤剂、浸膏剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液剂中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述质量检测和评价包括如下步骤：
