本发明属于纳米医药，涉及一种靶向调节脑膜淋巴系统的纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术：
1、肿瘤脑转移是常见的中枢神经系统疾病，大约有20％的癌症患者最终会发生脑部转移。转移性乳腺癌是继肺癌之后第二常见的与脑转移相关的癌症。在过去的几十年里，随着癌症研究的发展，大大提高了晚期乳腺癌患者的生存率，但脑转移的发病率也相应增加。乳腺癌患者尤其是人表皮生长因子受体2阳性和三阴性乳腺癌患者更容易发生脑转移，其脑转移发生率比激素受体阳性的乳腺癌患者高2-5倍。虽然现在bc的晚期治疗显著延长了患者的生存期，但乳腺癌脑转移的预后仍不理想。
2、近些年来，得益于纳米技术的快速发展，基于纳米材料的药物递送系统以非侵入或者侵入性的方式成为治疗脑肿瘤的潜在有效方法。非侵入性的方式主要包括不同的纳米药物递送系统携带特异性靶向脑内皮细胞受体的配体，比如转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体、胰岛素受体或者谷胱甘肽受体等，以此提高药物穿透bbb/btb的能力，增强乳腺癌脑转移的治疗效果。不幸的是，纳米颗粒递送到大脑和脑肿瘤中的积聚依然非常低，可能归因于bbb/btb的异质性和肿瘤细胞本身的特性。而侵入性方法主要包括通过套管介导的药物给药(即鞘内、脑室内或肿瘤内注射，以及对流增强给药等)或使用瞬时超声打开血脑屏障来增强药物递送到大脑。虽然这些策略可以改善脑肿瘤的药物摄取，然而，这些技术在空间上很难控制，长期使用可能会有问题，从而使这些方法的适用性受到限制。在过去的十年中，靶向免疫检查点已成为各种转移性实体恶性肿瘤的有效治疗策略。尽管免疫检查点疗法在治疗转移性乳腺癌方面取得了很好的临床进展，但是只有很少比例的患者从中受益，并且伴随有严重的副作用发生。根据多项临床试验的亚组分析，与其他部位转移的患者相比，肝癌或脑转移的乳腺癌患者对抗pd-1/l1免疫检查点治疗的应答率较低。因此，脑肿瘤的治疗在很大程度上仍然极具挑战性，迫切需要开发更有效的免疫治疗策略。
3、中枢神经系统由于缺少经典的淋巴引流系统，传统观点认为大脑是免疫豁免器官。然而，最近的研究发现大脑脑膜淋巴管(mlv)存在于硬脑膜的横窦和上矢状窦上，并与颈深部和浅部淋巴结相连。脑膜淋巴管作为脑脊液和颈部淋巴结交换液体和免疫细胞的桥梁，不仅在清除大脑代谢废物起到引流作用，同时在免疫监视并参与免疫调控多种神经系统疾病的发生和发展中起到非常重要的作用。基于以上发现，已有研究报道通过脑室注射腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)载体递送血管内皮生长因子c(vascularendothelial growth factor c,vegf-c)来调控mlvs的生成，以此来改善或增强阿尔兹海默症和脑胶质瘤的治疗效果(da mesquita s,louveau a,vaccari a,smirnov i,cornelison rc,kingsmore km,contarino c,onengut-gumuscu s,farber e,raper d,viar ke,powell rd,baker w,dabhi n,bai r,cao r,hu s,rich ss,munson jm,lopesmb,overall cc,acton st,kipnis j.functional aspects of meningeal lymphatics inageing and alzheimer's disease.nature.2018；560(7717):185-191.,hu x,deng q,mal,li q,chen y,liao y,zhou f,zhang c,shao l,feng j,he t,ning w,kong y,huo y,hea,liu b,zhang j,adams r,he y,tang f,bian x,luo j.meningeal lymphatic vesselsregulate brain tumor drainage and immunity.cell res.2020；30(3):229-243.,songe,mao t,dong h,boisserand lsb,antila s,bosenberg m,alitalo k,thomas jl,iwasaki a.vegf-c-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance ofbrain tumours.nature.2020；577(7792):689-694.)。但基于aav病毒载体来调控脑膜淋巴管的方式存在很多不足之处：首先aav具有较强的免疫原性，可能导致对同一宿主持续给药效果不佳；其次aav病毒载体对淋巴系统缺乏细胞靶向性；此外，脑室注射药物的方式具有侵入性且技术难度大，很难广泛应用于临床治疗研究。另一类是采用激光经颅照射的方式来调控mlvs增生，可有效改善阿尔兹海默症和脑室出血症状(wang m,yan c,li x,yang t,wu s,liu q,luo q,zhou f.non-invasive modulation of meningeal lymphaticsameliorates ageing and alzheimer's disease-associated pathology and cognitionin mice.nat commun.2024；16；15(1):1453.，li d,liu s,yu t,liu z,sun s,bragin d,shirokov a,navolokin n,bragina o,hu z,kurths j,fedosov i,blokhina i,dubrovskia,khorovodov a,terskov a,tzoy m,semyachkina-glushkovskaya o,zhud.photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents fortherapy of intraventricular hemorrhage.nat commun.2023 29；14(1):6104.)。然而对于经颅光照刺激来治疗脑部疾病的具体分子机制仍有待进一步探究。此外，也可通过脑膜淋巴管系统来递送纳米药物至脑内，有效控制帕金森症和原位脑胶质瘤的生长，但递送效率仍然有待提高。
技术实现思路
1、本发明旨在提供一种靶向调节脑膜淋巴系统的纳米颗粒及其制备方法与应用，凸显了脑膜淋巴逆向通路在bcbm免疫治疗中的潜力，不仅能为肿瘤脑转移的治疗提供了一种新方法新策略，也为无需通过bbb给药的中枢神经系统疾病治疗带来了巨大希望。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
3、本发明提供了一种靶向调节脑膜淋巴系统的纳米颗粒的制备方法，包括：
4、(1)将不同的磷脂dmpc、dmpe、mhpc和dspe-peg2000溶解于氯仿：甲醇混合液，所有成分混合完成后，水浴超声，保证各组分充分溶解；
5、(2)通入氮气去除溶剂，再放入干燥剂中继续真空抽滤以除去残留溶剂；
6、(3)加入50～60℃ddh2o，再冲入氮气，封口，振荡，使纳米颗粒彻底水化；
7、(4)将水化的纳米颗粒进行水浴式超声处理，使纳米颗粒变得均一透明，水浴温度48～50℃；
8、(5)加入仿载脂蛋白apoa-i的α-螺旋多肽r4f，缓慢滴加，一边滴加一遍摇晃，充入氮气，然后封口，4℃过夜孵育；
9、(6)将步骤(5)制备的纳米颗粒溶液通过30kda浓缩离心管离心，除去纳米颗粒中游离的多肽并将溶液置换成pbs缓冲液，合成得到含有r4f多肽的纳米颗粒α-plnp。
10、优选地，步骤(1)所述氯仿：甲醇混合液中氯仿和甲醇的体积比为3:1。
11、优选地，步骤(2)中，氮气通气持续时间为0.5～1h，真空抽滤时间为1～2h。
12、优选地，dmpc、dmpe、mhpc、dspe-peg2000和r4f的重量比为6：2：2：2.5：2。
13、优选地，步骤(1)溶解于氯仿：甲醇混合液中的成分还包括水溶性或者脂溶性的近红外荧光染料和碘油。
14、本发明还提供了一种靶向调节脑膜淋巴系统的纳米颗粒，通过上述制备方法制得。
15、本发明还提供了上述纳米颗粒在标记与追踪脑膜-颈部淋巴结系统中的应用。
16、本发明还提供了一种靶向调节脑膜淋巴系统的蜂毒肽纳米颗粒的制备方法，包括上述制备方法，以及在步骤(6)合成得到的α-plnp中加入蜂毒肽melittin，4℃孵育过夜，再通过浓缩离心去除游离的未结合的melittin，得到纳米颗粒α-m-plnp。
17、优选地，melittin与r4f的重量比为1：1。
18、本发明还提供了一种靶向调节脑膜淋巴系统的蜂毒肽纳米颗粒，通过上述制备方法制得。
19、本发明又提供了上述蜂毒肽纳米颗粒在制备脑肿瘤或肿瘤脑转移免疫治疗药物中的应用。
20、本技术中的蜂毒肽melittin通过静电效应与纳米颗粒α-plnp直接结合，不需要额外进行化学反应修饰，单独的melittin就能发挥肿瘤免疫抑制功能。该蜂毒肽纳米颗粒不仅可用于免疫治疗乳腺癌脑转移，还可以用于黑色素瘤脑转移，以及其他类型肿瘤的脑转移。此外，除了可以颈部皮下注射纳米颗粒，还可以通过直接注射纳米颗粒到颈部淋巴结内的方式来实现免疫治疗脑肿瘤或者肿瘤脑转移。
21、本发明的有益效果在于：
22、本发明提出了一种通过外周给药靶向和调节脑膜淋巴逆向途径来对乳腺癌脑转移瘤(bcbm)进行免疫治疗的潜在策略，从而可以绕过血脑屏障(bbb)的限制。ct/荧光双模态成像显示，通过小脑延髓池内注射磷脂纳米探针(α-plnps)可有效标记并远距离追踪从脑膜淋巴管(mlvs)到外周引流颈淋巴结(clns)的脑膜淋巴通路。而通过颈部皮下注射，α-plnps也成功标记了从clns到mlvs的反向通路，从而促进了向脑膜淋巴系统无创递送免疫调节剂。鉴于此，我们利用携带melittin的α-m-plnps诱导脑膜淋巴系统逆向通路的调节，通过激活cln中的抗原递呈细胞，促进cd8+t细胞向转移性脑肿瘤迁移，从而有效预防了bcbm的发生。本发明凸显了脑膜淋巴逆向通路在bcbm免疫治疗中的潜力，不仅能为肿瘤脑转移的治疗提供了一种新方法新策略，也为无需通过bbb给药的中枢神经系统疾病治疗带来了巨大希望。
1.一种靶向调节脑膜淋巴系统的纳米颗粒的制备方法，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氯仿：甲醇混合液中氯仿和甲醇的体积比为3:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，dmpc、dmpe、mhpc、dspe-peg2000和r4f的重量比为6：2：2：2.5：2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)溶解于氯仿：甲醇混合液中的成分还包括水溶性或者脂溶性的近红外荧光染料和碘油。
5.一种靶向调节脑膜淋巴系统的纳米颗粒，通过权利要求1～4任意一项所述的制备方法制得。
6.权利要求5所述的纳米颗粒在标记与追踪脑膜-颈部淋巴结系统中的应用。
7.一种靶向调节脑膜淋巴系统的蜂毒肽纳米颗粒的制备方法，包括权利要求1～3任意一项所述的制备方法，以及在步骤(6)合成得到的α-plnp中加入蜂毒肽melittin，4℃孵育过夜，再通过浓缩离心去除游离的未结合的melittin，得到纳米颗粒α-m-plnp。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，melittin与r4f的重量比为1：1。
9.一种靶向调节脑膜淋巴系统的蜂毒肽纳米颗粒，通过权利要求7所述的制备方法制得。
10.权利要求9所述的蜂毒肽纳米颗粒在制备脑肿瘤或肿瘤脑转移免疫治疗药物中的应用。
