本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官及其制备和应用。
背景技术：
1、肝癌是全球性的健康挑战问题，其中肝细胞癌(hepatocellμlar carcinoma，hcc)是最常见的肝癌类型，约占肝癌的90％。传统的治疗方法如手术部分切除、化疗和药物治疗等不能完全消除肝癌细胞，很容易导致肝癌复发和转移，严重降低患者治愈率和存活率。
2、肝脏是人体实质器官中巨噬细胞数量最多的器官，巨噬细胞也是肝脏中比例最高的免疫细胞群。因此，巨噬细胞在维持肝脏稳态和免疫应答方面具有重要意义。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,tams)在肿瘤微环境中受到细胞因子、趋化因子和其他调节分子的信号刺激后，会发生m1和m2极化。m1型巨噬细胞能杀伤肿瘤细胞和抵御病原体入侵，而m2型巨噬细胞主要发挥促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用。m1和m2的极化受多种细胞因子和蛋白的调控。例如，th1细胞因子(il-12和il-18)和toll样受体(tlr)会促进巨噬细胞极化成m1型，大量产生促炎细胞因子如il-1β、il-6、il-12、il-23和tnf-α；th2细胞因子如il-4、il-10和il-13会诱导巨噬细胞极化成m2型，分泌抑炎因子如il-10和tgf-β。
3、近年来，巨噬细胞在靶向药物耐药中的重要性也受到越来越多的重视。研究表明，清除肝癌组织中巨噬细胞后能显著增强索拉非尼的治疗效果，使得原位肿瘤缩小及肺内转移减少；m2型巨噬细胞通过大量分泌hgf因子拮抗索拉非尼对erk1/2/mapk信号通路的抑制效果，从而促进肝癌细胞生长；hcc患者肿瘤组织内tams密度与奥沙利铂治疗耐药程度呈正相关，tams能激活肝癌肿瘤细胞的自噬作用，提高对奥沙利铂耐受性；研究发现，肝癌患者中的wnt/β-catenin信号通路活化异常，肝癌细胞会通过wnt/β-catenin信号通路刺激巨噬细胞向m2极化，有可能抑制肝癌细胞对抗癌药物的摄入，产生耐药性。
4、目前对于肝癌耐药性的研究主要是基于细胞模型和动物模型。传统的2d细胞模型缺乏体内多细胞互作；而动物模型与人存在遗传背景差异，无法真实反应人体内情况。肿瘤类器官与亲本肿瘤具有高度组织学、遗传学相似性，且保留了亲本的肿瘤异质性和药物敏感性，可用于预测个体对药物的敏感。传统肿瘤类器官建模技术多依赖于手工将肿瘤组织来源的细胞与细胞外基质(如matrigel)混合后直接制备，该技术缺乏间充质、免疫细胞和血管化等，且类器官个体间和批次间差异大。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官及其制备和应用。本发明通过肝癌细胞与巨噬细胞互作制备具有耐药特征的类器官模型，利用微流控联动3d打印技术，将患者来源的组织提取细胞后，利用微流控微滴包裹技术将肝癌细胞与巨噬细胞共包裹制备具有免疫细胞微环境的高保真类器官，不仅具备与临床母本一致的遗传特征，而且能够高度模拟体内肿瘤耐药环境。本发明肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官具有巨噬细胞微环境特征和耐药性，并且来自人源样本，可以作为研究人源肝癌的耐药机制和筛选逆转耐药药物的有效模型。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术解决方案：
3、本发明提供一种肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官的制备方法，所述制备方法包括：
4、从患者来源的肝癌组织提取肝癌细胞；
5、将肝癌细胞﹑人源外周血巨噬细胞以及基质胶混合均匀，得到混匀物；
6、以所述混匀物为分散相，以油相试剂为连续相，利用微流控微滴包裹技术，将混匀物制备成微球，并将所得微球在37℃固化，固化后得到肝癌类器官前体；
7、将肝癌类器官前体在肝癌类器官培养基中悬浮培养，获得具有肝癌特征的肝癌类器官，即为所述肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官。
8、进一步地，所述肝癌细胞和人源外周血巨噬细胞的细胞数量之比是2:0.5-2:1；
9、优选地，总细胞数量(5-10)×104个的肝癌细胞和人源外周血巨噬细胞中加入1μl基质胶；
10、优选地，所述肝癌细胞和人源外周血巨噬细胞分别包含荧光基因；
11、优选地，所述肝癌细胞和人源外周血巨噬细胞分别包含不同的荧光基因。
12、进一步地，所述混匀物的流速为5-8μl/min，所述油相试剂的流速为100-110μl/min；
13、优选地，所述油相试剂为氟油。
14、进一步地，所述肝癌类器官前体的固化条件是：37℃，5％co2培养箱中固化15-30分钟。
15、进一步地，所述肝癌类器官培养基以dmem/f12为基础培养基，含有质量百分比1％的glμtamax、10mm gastrin、质量百分比1％的n2添加剂、5ng/ml fgf-2、100ng/ml重组人fgf10蛋白、5ng/ml重组人fgf-2蛋白、5ng/ml重组人egf蛋白、100ng/ml noggin、100ng/ml重组人r-spondin-1、10mm nicotinamide、25ng/ml重组人hgf蛋白和5μm y-27632。
16、进一步地，所述悬浮培养的条件为：在37℃、5％co2下培养7-10天，每2天更换1次肝癌类器官培养基。
17、进一步地，所述人源外周血巨噬细胞来源于肝癌患者的外周血样本；
18、优选地，所述人源外周血巨噬细胞的提取方法包括：
19、1)从人源新鲜血液中分离外周血单核细胞pbmc，再从人源pbmc中分选cd14+单核细胞；
20、2)将步骤1)中得到的单核细胞通过巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)诱导分化为巨噬细胞；
21、3)将步骤2)得到的巨噬细胞通过流式细胞术对巨噬细胞进行表征以确认细胞的纯度，巨噬细胞标记物包括cd68、cd86、cd163；
22、优选地，步骤2)单核细胞诱导分化为巨噬细胞的条件为：单核细胞浓度为1-2×106个/ml，在完全培养基中添加巨噬细胞集落刺激因子至终浓度为20-30ng/ml；
23、优选地，步骤3)中巨噬细胞在流式细胞术检测下，cd68+巨噬细胞百分比为90％-98％。
24、进一步地，从患者来源的肝癌组织提取肝癌细胞的方法为：使用消化酶消化人源肝癌组织为肝癌细胞悬液，即得；
25、优选地，人源肝癌组织与消化液的体积比为1:5；
26、优选地，所述消化酶配制方法：在10ml含有1％p/s双抗的dmem/f12培养基中加入10mg胶原酶、10μldna酶、10μl分散酶，现配现用，并用0.22μm滤膜过滤；
27、优选地，消化酶消化人源肝癌组织的条件：37℃孵育15-30分钟。
28、本发明还提供一种肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官，通过所述的制备方法制备得到。
29、本发明还提供所述的肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官在研究人源肝癌的耐药机制中的应用。
30、本发明还提供所述的肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官在筛选肝癌治疗药物中的应用。
31、本发明提供的类器官是一种具有免疫抑制性巨噬细胞微环境特征的肝癌耐药类器官。本发明实施例免疫荧光结果显示该类器官具有肝癌细胞的特性，高表达afp(肝组细胞)、epcam(肝上皮细胞)和cea(肝癌细胞)等肝癌细胞特征；免疫荧光和流式结果均显示，该类器官微球表达巨噬细胞的分型cd68(总巨噬细胞)，cd86(m1型巨噬细胞)，cd163(m2型巨噬细胞)，并且cd163表达强于cd86，说明该类器官微球以抑制性的巨噬细胞为主，且共包裹巨噬细胞的肝癌类器官的活性会高于仅仅包裹肝癌细胞的类器官。本发明构建的类器官模型具有肝癌特性和免疫抑制性巨噬细胞微环境特征。
32、本发明提供的具有耐药性的肝癌类器官，ic50结果显示，在一系列浓度的肝癌靶向治疗药物仑伐替尼处理下，共包裹巨噬细胞的肝癌类器官的ic50显著高于仅仅包裹肝癌细胞的类器官，证明本发明类器官的肝癌细胞与巨噬细胞互作模型具备耐药特征，基于本模型不仅能够研究肝癌耐药机制，而且有利于筛选出逆转肝癌耐药的特效药物，在肝癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。
33、本发明的有益效果为：
34、(1)传统手工制备的肿瘤类器官模型缺乏间充质、免疫和内皮等微环境细胞，且类器官个体间和批次间差异大。本发明提供了一种具有免疫抑制性巨噬细胞微环境特征的肝癌类器官，其基于微流控联动3d打印技术，将肝癌细胞和巨噬细胞共包裹后以高通量方式制造均一、可控的肝癌类器官前体，经体外培养熟化获得具有免疫抑制性巨噬细胞微环境特征的肝癌类器官，本发明类器官大小均一、形态可控，具有肝癌细胞和巨噬细胞的特异性指标。
35、(2)本发明提供的肝癌类器官具有耐药性，可用于研究肝癌耐药机制以及高通量筛选逆转肝癌耐药的特效药物，有助于开发新型靶向药物用于提高肝癌免疫治疗效果，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。
1.一种肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝癌细胞和人源外周血巨噬细胞的细胞数量之比是2:0.5-2:1；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混匀物的流速为5-8μl/min，所述油相试剂的流速为100-110μl/min；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固化的条件是：37℃，5％co2培养箱中放置15-30分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝癌类器官培养基以dmem/f12为基础培养基，含有质量百分比1％的glμtamax、10mm gastrin、质量百分比1％的n2添加剂、5ng/ml fgf-2、100ng/ml重组人fgf10蛋白、5ng/ml重组人fgf-2蛋白、5ng/ml重组人egf蛋白、100ng/mlnoggin、100ng/ml重组人r-spondin-1、10mm nicotinamide、25ng/ml重组人hgf蛋白和5μm y-27632。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述悬浮培养的条件为：在37℃、5％co2下培养7-10天，每2天更换1次肝癌类器官培养基。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人源外周血巨噬细胞来源于肝癌患者的外周血样本；
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，从患者来源的肝癌组织提取肝癌细胞的方法为：使用消化酶消化人源肝癌组织为肝癌细胞悬液，即得；
9.一种肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官，通过权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求8所述的肝癌细胞与巨噬细胞互作耐药类器官在研究人源肝癌的耐药机制中的应用，或在筛选肝癌治疗药物中的应用。
