本发明属于生物，具体涉及一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段及制备方法和应用。
背景技术：
1、全球人口中约10％～20％的成年人对猫有不同程度的过敏，猫过敏原作为常见的室内吸入性过敏原已成为引起人类呼吸系统过敏的第三大原因，世界卫生组织和国际免疫学会联合鉴定猫过敏原分别是分泌型球蛋白fel d1、血清白蛋白fel d2、胱抑素fel d3、脂质运载蛋白fel4和fel 7、免疫球蛋白fel d5和fel d6、以latherin样蛋白fel d8，fel d1是最主要的猫致敏原，96％的猫过敏患者体内含有fel d1特异性抗体，fel d4为脂质转运蛋白，是第二种最常见的猫致敏原，约63％的猫过敏患者体内含有fel d4特异性抗体。
2、猫过敏原fel d1和fel d4主要存在于皮脂腺和鳞状腺和鳞状上皮细胞、以及唾液腺、肛门腺和泪腺中，并通过猫咪舔毛和梳毛的方式转移至毛皮，最终储存在皮肤和毛皮上，通过空气传播，触发人类的免疫反应。
3、目前的猫过敏原均为原核表达，然而在自然条件下，完整的猫过敏原fel d1和feld4为哺乳动物细胞表达，当使用原核表达系统时，得到的抗原可能因其空间结构与其在自然条件下的不同，而导致抗原表位暴露不全，进而使该抗原产生的抗体活性较低。
4、目前研究中猫过敏原均为原核表达，然而在自然条件下，完整的猫过敏原fel d1和fel d4为哺乳动物细胞表达，所以在使用原核表达系统时，得到的抗原可能因其空间构象与其在自然条件下的不同，而导致抗原表位由功能性表位变为隐藏表位(位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位。存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能，称为隐蔽表位)，隐藏于抗原分子内部，进而使该抗原产生的抗体出现效价低的情况。而在本专利中，将抗原的表位进行分析截取，并以连接标签进行组合，确保所表达的重组蛋白抗原表位充分暴露，使得所有抗原表位均可产生对应的抗体。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段及制备方法和应用，将抗原的表位进行分析截取，并以连接标签进行组合，确保所表达的重组蛋白抗原表位充分暴露，使得所有抗原表位均可产生对应的抗体。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
3、一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段，由fel d1ⅰ链、fel d1ⅱ链和feld4的多个抗原决定簇组合而成，抗原决定簇之间通过ggggsggggs柔性linker或eaaakeaaak刚性linker连接，其氨基酸序列如seq id no:4所示。
4、进一步的，所述组合抗原片段的基因序列如seq id no:5所示。
5、含有上述组合抗原片段基因序列的重组载体或重组菌。
6、一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段的制备方法，将seq id no:5所示的基因序列导入大肠杆菌中，得到含有该基因序列的重组大肠杆菌菌株，通过表达纯化得到猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段。
7、一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段的应用，所述组合抗原片段用于制备猫过敏原fel d1和fel d4的多克隆抗体。
8、进一步的，将组合抗原片段免疫产蛋鸡，收集卵黄，纯化后得到抗猫过敏原fel d1和fel d4的卵黄抗体igy。
9、进一步的，所述卵黄通过水稀释法提取卵黄抗体，步骤包括：
10、将卵黄与水以1∶6-8体积比例混合均匀，调节ph值至5.0～5.2，置于4℃冰箱中静置过夜，次日以转速6000r/min离心20min，弃去沉淀取上清液，将上清液冻干成粉末，得到多克隆抗体粉末。
11、一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段在制备抗体组合物中的应用，所述抗体组合物由上述的卵黄抗体igy、卵磷脂、蔗糖水溶液组成，具有水包油包水结构；
12、内层水相为卵黄抗体igy的pbs溶液，
13、外层水相为10％的蔗糖水溶液，
14、油相为卵磷脂。
15、进一步的，抗体组合物的制备方法为：
16、(1)配制油相：将卵磷脂于37度水浴下溶于无水乙醇中，使卵磷脂的浓度为20mg/ml；
17、(2)配制内水相：多克隆抗体粉末溶于pbs中，使抗体浓度为1.65mg/ml；
18、(3)配制外水相：配制10％的蔗糖水溶液；
19、(4)制备油包水：将(2)中内水相缓慢滴加到有(1)油相中，通过高速剪切机，在6000rpm下剪切2min，形成油包水结构，得到含有多克隆抗体的脂质体溶液，水相和油相按4-5:1的体积比；
20、(5)制备水包油包水：将(4)中得到的含有多克隆抗体的脂质体溶液作为分散相添加到(3)的外水相中，在6000rpm下剪切2min形成水包油包水结构，得到蔗糖-卵磷脂-多克隆抗体的w1/o/w2乳液，脂质体溶液与外水相按3-4:1的体积比；
21、得到蔗糖-卵磷脂-多克隆抗体的w1/o/w2乳液中，多克隆抗体的s/n值为10-20，优选为16。
22、一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段在湿猫粮制备中的应用，所述湿猫粮中含有上述的抗体组合物，添加量为猫粮总重量的30％-50％，优选为45％。
23、本发明一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段及制备方法和应用的有益之处：本发明预测fel d1的ⅰ链、ⅱ链和fel d4氨基酸序列的抗原表位，截取后以连接标签进行组合，确保所表达的重组蛋白抗原表位充分暴露，使得所有抗原表位均可产生对应的抗体得到组合抗原片段，进而制备重组抗原和卵黄抗体，制备成脂质体缓释体系后添加进猫粮后，阻断猫口腔内的猫过敏原，降低猫咪饲主的过敏反应。
24、此外，fel d4还具备脂质转运蛋白的作用，fel d4卵黄抗体结合唾液中的fel d4后，中和其活性，使得脂质体能够更好的维持原有形态，因此fel d4卵黄抗体在本申请中，不但可以作为一种关键的过敏原抗体发挥作用，还可以作为一个关键成分，大幅提升卵黄抗体脂质体缓释功能。
1.一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段，其特征是：由fel d1ⅰ链、fel d1ⅱ链和fel d4的多个抗原决定簇组合而成，抗原决定簇之间通过ggggsggggs柔性linker或eaaakeaaak刚性linker连接，其氨基酸序列如seq id no:4所示。
2.根据权利要求1所述的猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段，其特征在于：所述组合抗原片段的基因序列如seq id no:5所示。
3.含有权利要求1-2任一项所示的组合抗原片段基因序列的重组载体或重组菌。
4.一种权利要求1-2任一项所示的猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段的制备方法，其特征是：将seq id no:5所示的基因序列导入大肠杆菌中，得到含有该基因序列的重组大肠杆菌菌株，通过表达纯化得到猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段。
5.一种权利要求1-2任一项所示的猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段的应用，其特征是：所述组合抗原片段用于制备猫过敏原fel d1和fel d4的多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段在制备卵黄抗体igy中的应用，其特征在于：将组合抗原片段免疫产蛋鸡，收集卵黄，纯化后得到抗猫过敏原fel d1和fel d4的卵黄抗体igy。
7.根据权利要求6所述的猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段的应用，其特征在于：所述卵黄通过水稀释法提取卵黄抗体，步骤包括：
8.一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段在制备抗体组合物中的应用，其特征在于：所述抗体组合物由权利要求6-7任一项所述的卵黄抗体igy、卵磷脂、蔗糖水溶液组成，具有水包油包水结构；
9.根据权利要求8所述的猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段的应用，其特征在于：抗体组合物的制备方法为：
10.一种猫过敏原fel d1和fel d4的组合抗原片段在湿猫粮制备中的应用，其特征在于：所述湿猫粮中含有权利要求8-9任一项所述的抗体组合物，添加量为猫粮总重量的30％-50％，优选为45％。
