本发明属于基因工程，具体为一种基于碱基编辑器的丝状真菌连续进化方法及其应用。
背景技术：
1、棘白霉素b是由丝状真菌发酵生产的天然产物，它是化学合成临床抗真菌药物阿尼芬净的前体。棘白霉素类药物能够非竞争性抑制病原真菌中β-1,3-葡萄糖合成酶的活性，阻碍细胞壁合成，起到抑制真菌生长的作用。近年来该类抗真菌类药物临床应用供不应求，然而棘白霉素b发酵过程中会产生大量天然产物副产物，这些副产物的合成会竞争性利用初级代谢产物前体，不利于其高效生产，同时也对后续产物纯化带来困难。
技术实现思路
1、为解决现有技术的不足，本发明在棘白霉素b生产菌株aspergillus nidulansatcc58396中建立了高效的crispr-cbe多位点碱基编辑技术，并依赖这一技术建立了一种通过连续转化的菌株进化方法，用于该菌中46个副产物基因簇的失活。为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
2、作为本发明的第一个方面，在于提供一种基于碱基编辑器的丝状真菌连续进化方法，包括如下步骤：
3、步骤1，构建含潮霉素b抗性基因hygr和丝状真菌复制元件ama1的胞嘧啶编辑器基因表达质粒；
4、步骤2，构建靶向棘白霉素b生产菌株基因组中副产物合成关键基因的trna-sgrna基因表达盒；
5、步骤3，构建同时表达五个靶向位点的trna-sgrna阵列表达文库；
6、步骤4，将crispr-cbe质粒和trna-sgrna阵列表达文库对菌株进行连续转化。
7、优选的，步骤1中，将含有构巢曲霉启动子ptef1、尿嘧啶dna糖基化抑制酶基因ugi、胞嘧啶脱氨酶ha3a(y130f)基因和部分ncas9基因序列通过化学合成法合成，合成ptef1-ugi-ha3a(y130f)-ncas9基因；并用内切酶sacii(neb，r0157v)酶切后纯化；将该dna片段插入用sacii酶切的pfc332(addgene#87845)质粒中，所获得的质粒即为表达ncas9-cbe蛋白的环形质粒。
8、进一步的，所合成的ptef1-ugi-ha3a(y130f)-ncas9基因序列如seq id no.1所示
9、优选的，步骤2中，针对棘白霉素b生产菌株基因组中每个副产物合成关键基因分别选择20-bp的靶向位点；利用ncas9-cbe靶向对应基因，实现c-t转变，并在该基因中引入终止密码子；每个靶向位点与grna序列连接，设计sgrna；利用棘白霉素b生产菌株中的甘氨酸转运trna基因序列作为表达sgrna的启动子，通过基因合成获得对应的sgrna基因序列，并克隆于puc19-ampr质粒，得到trna-sgrna表达质粒，puc19-ampr质粒的序列表如seq idno.2所示。
10、所述副产物合成的核心基因为46个，46个20-bp靶向位点基因序列如seq idno.3-seq id no.48所示。
11、优选的，步骤3中，将步骤2获得的各个trna-sgrna表达质粒等浓度混合；将获得的混合质粒作为模板，分别以引物对seq id no.51和seq id no.52、引物对seq id no.53和seq id no.54、引物对seq id no.55和seq id no.56、引物对seq id no.57和seq idno.58和引物对seq id no.59和seq id no.60扩增，获得5个亚库；以puc19-kanr为模板，利用引物对seq id no.61和seq id no.62扩增载体骨架，puc19-kanr的序列表如seq idno.63所示；将载体骨架和五个亚库dna片段混合，使用限制性内切酶basi和t4连接酶进行golden gate组装，并转化大肠杆菌，获得能够同时表达五个靶向位点的trna-sgrna阵列表达文库。
12、优选的，步骤4中，所述棘白霉素b生产菌株为a.nidulans atcc58396。
13、进一步的，步骤4中，进行六轮连续转化，在六轮转化结束后，将平板上的菌株稀释涂平板；待菌落长出后，在发酵培养基中培养，并用hplc测定其代谢轮廓，根据代谢轮廓选出副产物少、棘白霉素b产量高的优化菌株。
14、作为本发明的第二个方面，在于提供了所述方法制备的菌株。
15、作为本发明的第三个方面，在于提供了所述方法在棘白霉素b生产方面的应用。通过这一进化方案，筛选到副产物种类大幅减少，同时使棘白霉素b产量提升2.3倍的菌株。
16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17、1，本发明在棘白霉素b生产菌种aspergillus nidulans atcc58396中利用高效的crispr-cas9碱基编辑器，建立了一种通过连续转化的丝状真菌进化技术，用于该菌中副产物基因簇的失活。通过这一进化方案，筛选到副产物种类大幅减少，同时使棘白霉素b产量提升2.3倍的进化菌株。
18、2，本发明设计的基于碱基编辑器的连续进化技术可以在构巢曲霉中实现众多基因位点的同时改造，本实验获得了次级代谢副产物减少的菌株。同时，副产物的减少了前体损失，这为棘白霉素b高效生产和简化纯化步骤创造了条件。
1.一种基于碱基编辑器的丝状真菌连续进化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，将含有构巢曲霉启动子ptef1、尿嘧啶dna糖基化抑制酶基因ugi、胞嘧啶脱氨酶ha3a(y130f)基因和部分ncas9基因序列通过化学合成法合成，合成ptef1-ugi-ha3a(y130f)-ncas9基因；并用内切酶sacii(neb，r0157v)酶切后纯化；将该dna片段插入用sacii酶切的pfc332(addgene#87845)质粒中，所获得的质粒即为表达ncas9-cbe蛋白的环形质粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中，所合成的ptef1-ugi-ha3a(y130f)-ncas9基因序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，针对棘白霉素b生产菌株基因组中每个副产物合成关键基因分别选择20-bp的靶向位点；利用ncas9-cbe靶向对应基因，实现c-t转变，并在该基因中引入终止密码子；每个靶向位点与grna序列连接，设计sgrna；利用棘白霉素b生产菌株中的甘氨酸转运trna基因序列作为表达sgrna的启动子，通过基因合成获得对应的sgrna序列，并克隆于puc19-ampr质粒，得到trna-sgrna表达质粒，puc19-ampr质粒的序列表如seq id no.2所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述副产物合成的核心基因为46个，46个20-bp靶向位点基因序列如seq id no.3-seq id no.48所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3中，将步骤2获得的各个trna-sgrna表达质粒等浓度混合；将获得的混合质粒作为模板，分别以引物对seq id no.51和seq idno.52、引物对seq id no.53和seq id no.54、引物对seq id no.55和seq id no.56、引物对seq id no.57和seq id no.58和引物对seq id no.59和seq id no.60扩增，获得5个亚库；以puc19-kanr为模板，利用引物对seq id no.61和seq id no.62扩增载体骨架，puc19-kanr的序列表如seq id no.63所示；将载体骨架和五个亚库dna片段混合，使用限制性内切酶basi和t4连接酶进行golden gate组装，并转化大肠杆菌，获得能够同时表达五个靶向位点的trna-sgrna阵列表达文库。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述棘白霉素b生产菌株为a.nidulans atcc58396。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，进行六轮连续转化，在六轮转化结束后，将平板上的菌株稀释涂平板；待菌落长出后，在发酵培养基中培养，并用hplc测定其代谢轮廓，根据代谢轮廓选出副产物少、棘白霉素b产量高的优化菌株。
9.根据权利要求1所述的方法制备的菌株。
10.根据权利要求1所述的方法在棘白霉素b生产方面的应用。
