本发明属于生物工程，具体涉及一种细胞色素p450单加氧酶cyp68n3在以甾体化合物为底物进行c11α-羟基化中的应用。
背景技术：
1、甾体类药物在临床上被广泛应用于治疗风湿、心血管、淋巴性白血病、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调等疾病。c11α-羟基化的甾体化合物具有杀菌、免疫调节、生育控制、增加药物疗效等作用，也可用作多种重要药物合成的关键中间体(greyling,etal.,s.afr.j.anim.sci,1999,29(3):179)。其中，18-甲基诺龙、诺龙、18-甲双酮、17-羟基黄体酮、孕酮等甾体的c11α-羟基化产物均是市场上常见避孕药的前体。甲基双烯醇酮可以通过化学脱水和酯化反应合成甾体药物醋酸群勃龙(兽药)并应用于疯牛病的预防。11α-羟基坎利酮是合成依普利酮的关键中间体，而依普利酮作为一种治疗心血管疾病的选择性醛固酮受体拮抗剂，可有效阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统(raas)的作用，具备广阔的市场前景。雄烯二酮(ad)和雄二烯二酮(add)的c11α-羟基化甾体产物则都是合成卤化皮质激素类药物的关键中间体(petric s.,et al.,j biotechnol,2010,150(3):428-437)。
2、18-甲基诺龙的c11α-羟基化合物是合成左炔诺孕酮、依托孕烯以及口服避孕药地索高诺酮、内美通的重要中间体。其中地索高诺酮还可用于治疗女性更年期综合征和子宫内膜异位症，与睾酮一起用作男性的激素避孕药。地索高诺酮的孕激素活性比18-甲基炔诺酮强1倍，比炔诺酮强18倍。而且这种药物只有轻微的雄激素和蛋白质同化代谢活性，对脂代谢无不良影响。2020年，地索高诺酮为美国排名第120位的最常用处方药，处方次数超过544万，处方销售额约为18300万美元(https://clincalc.com/drugstats/)。目前对于地索高诺酮的合成路线已经有多种报道。但对于关键中间体11α-oh-18-甲基诺龙的合成，存在化学路线长、反应条件苛刻、催化剂价格昂贵等问题；更为严峻的是生产过程会用到大量盐酸等溶剂，造成严重的环境污染(us20130123523a1)。
3、与化学法相比，生物催化有着明显的优势，例如：反应条件温和、环境污染小、整体工艺绿色清洁等。生物催化符合“绿色化学”的发展方向，也是目前合成羟基化甾体最简便有效的手段(liu et al.,bioresource technol 2011；102:9368-9373)。2017年，天津大学刘晓光等从赭曲霉中成功挖掘出一种对甾体底物具有c11α-羟基化活性的p450酶cyp68j5(yang x,et al.,adv appl microbiol,2018:203.)，但该野生型酶对甾体底物的c11α-羟化选择性不高，对孕酮选择性为69.7％，对双酮选择性仅为58％。此外，一种存在于巨大芽孢杆菌atcc 13368中的p450酶cyp106a2被发现具有c11α-羟基化活性，但野生型对甾体底物的c11α-羟化选择性仅有18％(cn113667650a)。2012年，nguyen等人报道了cyp106a2(t89n/a395i)突变体对孕酮的c11α-羟基化选择性提升到81％(nguyen k t,etal.chembiochem,2012,13(8):1161-1166.)，但尚未见到这些酶对18-甲基诺龙的c11α-羟基化报道。
4、金龟子绿僵菌作为广谱生物杀虫剂具有害虫致病力强、寄宿范围广、无毒素残留等优势，应用前景广阔。但目前对于绿僵菌的研究主要集中于农业运用和基因遗传育种等方面。1997年，上海医科大学史济平等人在底物浓度为0.2％(w/v)的情况下用绿僵菌成功c11α-羟化19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-双酮(fa)，但转化率仅为36％(史济平等，上海医科大学学报；1997,04)。此外，在cn107974481a中，赵小娟、杨芳等人用绿僵菌菌液转化18-甲基诺龙生成11α-oh-18-甲基诺龙，但收率不理想，仅有70％-80％。可见，目前应用微生物转化合成11α-oh-18-甲基诺龙这一步骤仍存在活性低的问题。而且，真菌生产菌株遗传背景不清晰，分子操作困难。这些问题限制了对菌株的定向分子遗传改造，严重影响了其在甾体药物合成中的应用。因此，若能挖掘对18-甲基诺龙定点11α-羟化的酶，通过酶分子改造技术对其进行功能强化，并对反应体系进行优化，进而高效率、高选择性合成其重要中间体11α-oh-18-甲基诺龙，则可望更好地理解甾体立体选择性、底物特异性的结构基础，显著提高包括地索高诺酮在内的多种全球通用避孕药物的整个合成效率，有力推动包括地索高诺酮在内的多种避孕药物生产技术的革新(图1)。另外，由于18-甲基诺龙、18-甲双酮、坎利酮等多种甾体化合物的c11α-羟基化产物均具有非常重要的药用价值。若挖掘到的c11α-羟基化酶有较为广泛的底物谱，则将加快该类药物的研发速度并降低其生产成本和价格。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明旨在提供一种高选择性催化18-甲基诺龙c11α-羟基化的酶，并构建该酶的高效催化反应体系，再在此基础上进一步挖掘拓展该酶的甾体底物谱。
2、本发明的技术方案具体如下：
3、本发明第一方面提供了一种高选择性催化c11α-羟基化的p450单加氧酶cyp68n3，该酶的氨基酸序列为a1)或a2)：
4、a1)如seq id no.1所示；
5、a2)与seq id no.1所示序列具有至少80％同源性且与seq id no.1所示序列具有相同功能的序列。
6、发明人观察到金龟子绿僵菌eeg016可以对18-甲基诺龙的c11位进行羟化，基于这一现象，通过甾体底物诱导、转录组测序、候选基因克隆等大量试验探索，挖掘得到一个表达上调的p450基因，将该基因编码的氨基酸序列(如seq id no.1所示)提交到p450命名网站(https://drnelson.uthsc.edu)，被命名为cyp68n3。目前关于该基因编码的p450酶的功能以及其对甾体c11α-羟基化的高选择性都尚未见报道。
7、本发明第二方面提供了编码所述p450单加氧酶cyp68n3的核酸分子，所述核酸分子为b1)或b2)：
8、b1)为金龟子绿僵菌eeg016的p450基因；
9、b2)与b1)限定的序列具有至少50％同源性且编码所述p450单加氧酶cyp68n3的dna分子。
10、本发明第三方面提供了p450单加氧酶cyp68n3高效催化甾体底物c11α-羟基化的反应体系，具体为：诱导培养带有cyp68n3基因的转化子，再加入甾体底物进行全细胞生物催化反应。
11、鉴于真菌生产菌株遗传背景不清晰，分子操作困难等问题导致的该酶在甾体药物合成应用中的限制，本发明通过更换cyp68n3基因表达细胞底盘，优化提升了该酶对甾体底物的催化活性。
12、在上述的反应体系中，转化子由带有cyp68n3基因的重组质粒转化至宿主细胞所得。需要说明的是，所述的重组质粒可通过本领域常规方法，将金龟子绿僵菌eeg016中编码cyp68n3的基因片段连接于各种载体上构建而成。所述的载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组质粒可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的p450单加氧酶即可。所述的宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组质粒可稳定地自行复制，并且编码cyp68n3的基因cyp68n3可被有效表达即可。而且，针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。
13、如当宿主细胞为酿酒酵母时，质粒载体优选为pyes2质粒。在本发明一实施例中，具体通过下述方法制得转化子：将pcr扩增所得的核酸产物与表达载体pyes2分别用引物扩增，经t5核酸外切酶切割形成互补的粘性末端，冰上放置后42℃温育形成含有金龟子绿僵菌eeg016基因cyp68n3的重组质粒，再将重组质粒转化至酿酒酵母invsc1得到。
14、当宿主细胞为毕赤酵母时，质粒载体优选为ppicza质粒。在本发明一实施例中，具体采用ppicza质粒和毕赤酵母x33构建得到转化子。
15、实验表明，本发明构建的重组酿酒酵母转化子在全细胞催化体系中与1mm底物反应72h，对18-甲基诺龙的转化率为84.5％，c11α-选择性为85.3％；更为优异的是，利用本发明构建的重组毕赤酵母转化子进行全细胞生物催化时，在与1mm底物反应72h后，18-甲基诺龙的转化率高达99.0％，且目标产物选择性也能够达到98.5％。可见，本发明更换cyp68n3基因表达细胞底盘后，能够显著提升该酶对甾体底物的催化活性和选择性。
16、本发明第四方面挖掘拓展了p450单加氧酶cyp68n3的甾体底物谱，实验表明：该酶对诺龙、17羟基黄体酮、孕酮、18甲基双酮和坎利酮等多种甾体药物均有良好的催化活性和c11α-羟基化选择性，底物谱广泛。
17、相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明首次从真菌中克隆并表征出p450单加氧酶cyp68n3，且该酶具有甾体高选择性c11α-羟基化功能，并通过对其在酵母体系中进行异源表达，进一步提升了全细胞催化的效率和选择性，如在1mm底物浓度条件下反应72h，18-甲基诺龙的转化率可高达99.0％，且c11α-羟基化产物选择性也高达98.5％；而且，cyp68n3对诺龙、17羟基黄体酮和坎利酮等多种甾体药物均有良好的催化活性和c11α-羟基化选择性，底物谱广泛，可见该p450酶cyp68n3具有良好的工业应用前景。
1.p450单加氧酶cyp68n3在催化甾体底物c11α-羟基化中的应用，其特征在于，所述p450单加氧酶cyp68n3的氨基酸序列如seq id no.1所示，或为与seq id no.1所示序列具有至少80％同源性且与seq id no.1所示序列具有相同功能的序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甾体底物为18-甲基诺龙、18-甲基双酮、17羟基黄体酮、坎利酮、孕酮或诺龙。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述p450单加氧酶cyp68n3的基因cyp68n3来源于金龟子绿僵菌eeg016。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于扩增所述基因的引物序列如seq idno.2～3所示。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，诱导培养带有基因cyp68n3的转化子，再加入甾体底物进行全细胞生物催化反应。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转化子由带有基因cyp68n3的重组质粒转化至宿主细胞所得。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组质粒由基因cyp68n3与ppicza质粒连接得到。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母细胞，且所述重组质粒由基因cyp68n3与pyes2质粒连接得到。
