本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种利用长片段长读长测序平台检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病，属于常染色体隐性遗传，高发地区包括中国南方、东南亚、地中海地区、印度、中东和非洲等地区。地中海贫血主要分为α-地贫和β-地贫，分别是α-珠蛋白或β-珠蛋白的合成缺失或不足导致的1,2,3。
2、α-珠蛋白基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5’- hbz- hbzps- hbm- hba1ps- hba2(α2)- hba1(α1)- hbq-3’。其中只有 hba1和 hba2两个基因在胚胎和成年人中都具有编码珠蛋白的能力。 hba1和 hba2基因的突变包括缺失型突变和非缺失型突变，综合ithanet，hbvar，lovd和lovd-china地贫数据库，目前在世界范围已经发现约50种α-珠蛋白基因簇区域的缺失，和超过900种hba1和hba2基因的非缺失型突变。除此之外还有些罕见的结构变异，如αααanti3.7，αααanti4.2，hkαα和antihkαα等。β-珠蛋白基因簇位于11号染色体，共包含5个基因位点：5’- hbe- hbg2- hbg1- hbd(δ)- hbb(β)-3’。其中 hbb基因在成年人中编码珠蛋白，其他四个基因均在胚胎发育过程中表达，或者在成年人中表达量非常低。绝大多数导致β-地贫的突变是非缺失的，少数为大片段缺失4,5。综合ithanet，hbvar，lovd和lovd-china地贫数据库，目前在世界范围已经发现超过1000种hbb基因的非缺失型突变。迄今为止在中国人群中发现了129种β-珠蛋白基因非缺失型突变。
3、地中海贫血具有先天性，终身性和家族聚集性的特点，目前尚无理想的治疗方法，患者需要终身治疗，不仅忍受痛苦还要付出高昂的代价3。但是由于遗传病通常是通过基因携带者的生殖行为而发生的，所以可以采用辅助生殖技术阻断其向后代传递，降低遗传病患者的数量。胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，pgt）是在胚胎植入子宫前对胚胎进行遗传学检测，选择正常或者不致病胚胎移植。
4、pgt包括胚胎植入前染色体非整倍体检测（pgt for aneuploidy detection，pgt-a）、胚胎植入前染色体结构异常检测（pgt for chromosomal structuralrearrangements，pgt-sr）和胚胎植入前单基因遗传病检测（pgt for monogenic/single-gene defects，pgt-m）。pgt-a是针对女方高龄、复发性流产、反复种植失败、不良孕产史及男方严重畸精子症等患者。pgt-sr是针对父母双方或之一存在染色体结构异常，如倒位、平衡易位、罗氏易位、插入易位等。pgt-m是针对患有或携带已知单基因遗传病的父母，比如地中海贫血等，在胚胎植入前对胚胎进行单基因遗传病的检测6,7,8。pgt技术首先要通过活检技术获取可用于检测的胚胎遗传物质，活检技术根据时间可分为极体活检、卵裂球活检与囊胚滋养层细胞活检：极体活检是在取卵当天（或受精后第1天）获取极体用于遗传学检测；卵裂球活检则是在受精后第3天（6~8个细胞阶段），获取1~2个细胞进行遗传学检测；囊胚滋养层细胞活检是在受精后第5天或第6天，胚胎发育至囊胚阶段时，获取5~10个滋养层细胞用于遗传学检测9。
5、由于pgt技术获得的细胞数很少，可利用的遗传物质有限，所以一般要进行全基因组扩增（whole genome amplification，wga）。目前全基因组扩增的方式主要分为3类，一类是基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）技术的方法，比如引物延伸预扩增（primer extension preamplification pcr，pep-pcr）和简并寡核苷酸引物pcr（degenerate oligomer primer pcr，dop-pcr）；另一类为恒温全基因组扩增反应，比如多重置换扩增（multiple displacement amplification，mda）；第三类是多次退火环状循环扩增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，malbac）。虽然现在有很多商业试剂盒，关键参数表现不同，但是每种方法每种试剂盒都会有扩增偏好，等位基因脱扣（allele dropout，ado）和变异系数等10，造成假阴性或假阳性，导致诊断失败甚至误诊。
6、为了提高诊断的准确性，pgt-m需要同时进行单倍型连锁分析。目前主流的连锁分析方式有三种：短串联重复序列(short tandem repeat，str)，snp芯片（single-nucleotide polymorphisms arrays）和第二代测序（next-generation sequencing，ngs）技术7。但是str技术相对繁琐且成本高，且str和snp芯片只能分析已知的位点，这样会错过一些未知的潜在的可以用来做单倍体分型的snp位点。ngs技术只能检测大约300个碱基的dna片段，然而人类基因组中snp位点平均间隔约为1000个碱基，因此，ngs平均只能从每个dna片段中获得不到最多一个snp位点，所以寻找连续的snp很困难，只能选择有限的snp位点构建单体型，造成snp位点的浪费。并且以上三种方法都需要先证者，但是有些家庭没有先证者，或者无法获得先证者的遗传物质。目前不需要先证者的方法还有三代全基因组测序，但是，这种方法价格昂贵，临床应用市场可及推广性差。例如，现有技术中专利申请cn108531582a公开了一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法。利用包含1354个引物组成的引物组合并基于ngs技术，该方法实现了地贫相关基因突变情况的检测。此外，该方法利用父母和先证者与α-地贫致病基因hba1紧密连锁多态性位点(snp)在染色体上的位置和基因型构建单体型，并利用已经建好的单体型对胚胎是否致病进行判断。
7、目前基于str、snp芯片、ngs和长读长全基因组测序等方法，主要有以下几方面局限性：
8、依赖于先证者：但是有些家庭没有先证者，或者无法获得先证者的遗传物质；
9、连锁分析效率低：只能利用已知的位点，或只能选择有限的位点构建单体型，造成连锁位点的浪费，需要很多连锁片段才能分析；
10、成本高：传统方法操作繁琐、成本高、时间长，三代全基因组测序价格昂贵。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决现阶段人类胚胎α-地贫检测依赖于先证者，连锁分析效率低，检测和分析繁琐，成本高，时间长的问题。通过长片段pcr同时扩增α-地贫基因突变相关片段和 hba基因上下游1mb范围内连锁snp位点的4个连锁片段，及制备长片段测序文库，实现全面、精确，高效和快速检测多个样品 hba基因多种突变的目标，在保证胚胎检测的准确性和灵敏度的前提下，避免了必须需要先证者的问题，又降低了患者检测费用压力。
2、鉴于此，本发明提供了一种基于多重长片段pcr扩增和长片段测序且不需要先证者的方法来检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变。长片段pcr扩增被分在一个反应管中实现，分别扩增用于检测 hba1/2基因位点引物范围内所有点突变的片段和检测大片段缺失的gap片段，以及 hba基因上下游1mb范围内连锁snp位点的连锁片段；结合读长测长的长片段测序平台的读长测长等特点，可以实现准确、快速并高通量地检测人类胚胎α-地贫的基因突变。本发明涉及的方法操作简便，长片段pcr和长片段文库质量可靠且重复性强，有利于长片段测序技术在临床检测上的应用。
3、本发明的第一方面提供了一种引物组，其用于同时扩增 hba基因区域的多种突变及其上下游1mb范围内连锁的单核苷酸多态性（snp）位点。
4、其中用于扩增 hba基因区域多种突变的5条引物如下：hba-f1、hba-f2、hba-f3、hba-r1和hba-r2，其序列分别如seq id no: 1-5所示；
5、其中用于扩增 hba基因上下游1mb范围内连锁snp位点的8条引物如下：l1-f、l1-r、l2-f、l2-r、l3-f、l3-r、l4-f和l4-r，其序列分别如seq id no: 6-13。
6、上述一共13条引物的位置如图1所示。所述引物可同时扩增 hba1/2基因位点引物范围内的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列，以及上下游1mb范围内连锁片段的序列。
7、在一些实施方案中，所述引物组用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；其中所述点突变和所述结构变异包含来自ithanet、hbvar、lovd和lovd-china四个地中海贫血数据库收录的 hba基因突变。
8、在一些优选的实施方案中，所述结构变异包含大片段缺失。例如，所述大片段缺失包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6。
9、在一些实施方案中，所述引物的扩增片段大小为1k至20kb，即扩增产物的大小约为1k至20kb。
10、在一些优选的实施方案中，如果引物位置有snp，则使用简并碱基引物。
11、在一个具体的实施方案中，利用所述引物组在一个反应管中完成多重-长片段pcr扩增。
12、在一个优选的实验方案中，所述引物组用于1个体系的多重-长片段pcr扩增 hba基因片段和连锁片段，总计超过5个目标片段。
13、在一个优选的实施方案中，所述引物组在一个体系扩增超过5个目标片段，包括 hba基因区域至少1个片段和连锁区域4个片段，从而至少可以同时检测： hba1/2基因位点引物范围内所有点突变、28种大片段缺失（包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6），以及上下游1mb范围内连锁的snp位点。其中点突变和结构变异包含来自四个地贫数据库（ithanet，hbvar，lovd和lovd-china）收录的 hba基因突变。
14、在一个实施方案中，可以在所述引物的5’端加入5-50nt的不同序列的dna，即dna条形码（barcode），用于区分不同的样本；优选地，f和r引物的5’端barcode可以相同或者不同，本领域技术人员可以根据需要选择。
15、在一个实施方案中，所述引物组用于同时直接检测hba基因区域和长连锁片段的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁且是不依赖于先证者的pgt-m检测。
16、本发明的引物组可以用于1个体系的多重-长片段pcr扩增包括所有引物范围内片段。再结合后续的长片段测序平台，可以直接检测 hba基因片段及长连锁片段的单体型，其利用囊胚和父母样本推断单体型连锁，真正实现不依赖于先证者的pgt-m检测。
17、本发明第二方面提供了一种用于同时检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的试剂盒，其包括以下试剂：
18、（1）用于多重长片段pcr扩增的试剂；
19、（2）用于构建长片段测序文库的试剂；
20、其中所述用于多重长片段pcr扩增的试剂包含如本发明第一方面所述的引物组。
21、在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的引物组选自以下13条（引物位置如图1所示）引物中的多条引物：
22、用于扩增 hba基因区域多种突变的5条引物如下：hba-f1、hba-f2、hba-f3、hba-r1和hba-r2，其序列分别如seq id no: 1-5所示；
23、用于扩增 hba基因上下游1mb范围内连锁snp位点的8条引物如下：l1-f、l1-r、l2-f、l2-r、l3-f、l3-r、l4-f和l4-r，其序列分别如seq id no: 6-13。
24、所述引物可同时扩增 hba1/2基因位点引物范围内的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列，以及上下游1mb范围内连锁片段的序列。
25、在一些实施方案中，所述试剂盒用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；其中所述点突变和所述结构变异包含来自ithanet、hbvar、lovd和lovd-china四个地中海贫血数据库收录的 hba基因突变。
26、在一些优选的实施方案中，所述结构变异包含大片段缺失。例如，所述大片段缺失包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6。
27、在一些实施方案中，所述引物的扩增片段大小为1k至20kb，即扩增产物的大小约为1k至20kb。
28、在一些优选的实施方案中，如果引物位置有snp，则使用简并碱基引物。
29、在一个实施方案中，可以在所述引物的5’端加入5-50nt的不同序列的dna，即dna条形码（barcode），用于区分不同的样本；优选地，f和r引物的5’端barcode可以相同或者不同，本领域技术人员可以根据需要选择。
30、在一个实施方案中，所述用于多重长片段pcr扩增的试剂还包括dna聚合酶、反应缓冲液和引物。
31、在一个实施方案中，对于利用所述试剂盒得到的长片段pcr扩增产物在进行下一步反应前，可以纯化或者不纯化，本领域技术人员可以根据需要选择。
32、在一个具体的实施方案中，利用所述试剂盒的多重-长片段pcr扩增在一个反应管中完成。
33、在一个优选的实验方案中，所述试剂盒用于1个体系的多重-长片段pcr扩增 hba基因片段和连锁片段，总计超过5个目标基因片段。
34、在一个优选的实施方案中，所述试剂盒在一个体系扩增超过5个目标片段，包括 hba基因区域至少1个片段和连锁区域4个片段，从而至少可以同时检测： hba1/2基因位点引物范围内所有点突变、28种大片段缺失（包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6），以及上下游1mb范围内连锁的snp位点。其中点突变和结构变异包含来自四个地贫数据库（ithanet，hbvar，lovd和lovd-china）收录的 hba基因突变。
35、在一个实施方案中，所述试剂盒用于同时直接检测hba基因区域和长连锁片段的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁且是不依赖于先证者的pgt-m检测。
36、在一个优选的实施方案中，长片段测序选自pacific biosciences公司（pacbio）的基于smrt测序或ont公司的nanopore测序平台。
37、在一个具体的实施方案中，smrt文库接头连接可以使用平末端连接或ta连接的方式。
38、在一个具体的实施方案中，smrt通用平末端接头序列为5’-patctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagat-3’（seq id no: 14），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的dna（barcode）形成不同带barcode的接头适配子。带有不同barcode的smrt文库可以混合在一起测序。
39、在一个具体的实施方案中，smrt通用ta接头序列为5’-patctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt-3’（seq id no: 15），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的dna（barcode）形成不同带barcode的接头适配子。带有不同barcode的smrt文库可以混合在一起测序。
40、在一个实施方案中，smrt接头可以带或者不带barcode。优选地，smrt接头带pacbio公司设计的barcode或者自行设计的barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
41、在一个优选的实施方案中，所述smrt文库与pacbio公司测序平台匹配。
42、在一个优选的实施方案，其中所述用于构建长片段nanopore文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、dna纯化磁珠、80%乙醇和反应缓冲液。
43、在一个实施方案中，nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或ta连接的方式。
44、在一个实施方案中，nanopore接头可以带或者不带barcode。优选地，nanopore接头带ont公司设计的barcode或者自行设计的barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
45、在一个优选的实施方案中，所述nanopore文库与ont公司测序平台匹配。
46、本发明第三方面提供了一种同时检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的系统，其包括以下模块：
47、（1）采集模块：获得受试者样本；
48、（2）扩增模块：所述样本进行多重长片段pcr扩增，包括所述样本中 hba基因的相关片段，例如检测 hba1/2基因位点引物范围内所有点突变的1个片段和检测大片段缺失的gap片段，及 hba基因上下游1mb范围内的4个连锁片段；
49、（3）文库构建模块：构建长片段测序文库；
50、（4）测序模块：测序并分析基因突变类型及不同片段之间的连锁关系；
51、其中所述扩增模块中的多重长片段pcr扩增采用如本发明第一方面所述的引物组或本发明第二方面所述的试剂盒进行。
52、在一个实施方案中，可以在所述引物的5’端加入5-50nt的不同序列的dna，即dna条形码（barcode），用于区分不同的样本。
53、在一个优选的实施方案中，f和r引物的5’端barcode可以相同或者不相同，本领域技术人员可以根据需要选择。
54、在一个优选的实施方案中，所述系统至少可以用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；其中所述点突变和所述结构变异包含来自ithanet、hbvar、lovd和lovd-china四个地中海贫血数据库收录的 hba基因突变。
55、在一些优选的实施方案中，所述结构变异包含大片段缺失。例如，所述大片段缺失包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6。
56、在一个具体的实施方案中，所述系统中的多重-长片段pcr扩增在一个反应管中完成。
57、在一个优选的实验方案中，所述系统用于1个体系的多重-长片段pcr扩增 hba基因片段和连锁片段，总计超过5个目标基因片段。
58、在一个优选的实施方案中，所述系统在一个体系扩增超过5个目标片段，包括 hba基因区域至少1个片段和连锁区域4个片段，从而至少可以同时检测： hba1/2基因位点引物范围内所有点突变、28种大片段缺失（包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6），以及上下游1mb范围内连锁的snp位点。其中点突变和结构变异包含来自四个地贫数据库（ithanet，hbvar，lovd和lovd-china）收录的 hba基因突变。
59、在一个实施方案中，所述系统用于同时直接检测hba基因区域和长连锁片段的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁且是不依赖于先证者的pgt-m检测。
60、在一个具体的实施方案中，其中所述系统的测序模版中长片段测序选自pacbio公司的smrt测序或ont公司的nanopore测序。
61、在一个实施方案中，smrt文库接头连接可以使用平末端连接或ta连接的方式。
62、在一个实施方案中，smrt文库通用平末端接头序列为5’-patctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagat-3’（seq id no: 14），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的dna（barcode）形成不同带barcode的接头适配子。带有不同barcode的pacbio文库可以混合在一起测序。
63、在一个实施方案中，smrt文库通用ta接头序列为5’-patctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt-3’（seq id no: 15），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的dna（barcode）形成不同带barcode的接头适配子，带有不同barcode的pacbio文库可以混合在一起测序。
64、在一个实施方案中，smrt文库接头可以带或者不带barcode。在优选的实施方案中，smrt文库接头带pacbio公司设计的barcode或者自行设计的barcode。本领域技术人员可以根据需要选择。
65、在一个优选的实施方案中，所述smrt文库与pacbio公司测序平台匹配。
66、在一个实施方案中，nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或ta连接的方式。
67、在一个实施方案中，nanopore接头可以带或者不带barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。优选地，nanopore接头带ont公司设计的barcode或者自行设计的barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
68、在一个优选的实施方案中，所述nanopore文库与ont公司测序平台匹配。
69、本发明第四方面提供了如本发明第一方面所述的引物组在制备用于检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的试剂盒中的应用。
70、本发明第五方面提供了一种检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的方法，其包括以下步骤：
71、（i）获得受试者样本；
72、（ii）对所述样本进行多重长片段pcr扩增；
73、（iii）构建长片段测序文库；
74、（iv）测序并分析基因突变类型及不同片段之间的连锁关系；
75、其中所述多重长片段pcr扩增采用如本发明第一方面所述的引物组或如本发明第二方面的试剂盒进行。
76、在一个实施方案中，可以在所述引物的5’端加入5-50nt的不同序列的dna，即dna条形码（barcode），用于区分不同的样本。
77、在一个优选的实施方案中，f和r引物的5’端barcode可以相同或者不相同，本领域技术人员可以根据需要选择。
78、在一个优选的实施方案中，所述方法至少可以用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；其中所述点突变和所述结构变异包含来自ithanet、hbvar、lovd和lovd-china四个地中海贫血数据库收录的 hba基因突变。
79、在一些优选的实施方案中，所述结构变异包含大片段缺失。例如，所述大片段缺失包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6。
80、在一个具体的实施方案中，所述方法的多重-长片段pcr扩增在一个反应管中完成。
81、在一个优选的实验方案中，所述方法用于1个体系的多重-长片段pcr扩增 hba基因片段和连锁片段，总计超过5个目标基因片段。
82、在一个优选的实施方案中，所述方法在一个体系扩增超过5个目标片段，包括 hba基因区域至少1个片段和连锁区域4个片段，从而至少可以同时检测： hba1/2基因位点引物范围内所有点突变、28种大片段缺失（包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6），以及上下游1mb范围内连锁的snp位点。其中点突变和结构变异包含来自四个地贫数据库（ithanet，hbvar，lovd和lovd-china）收录的 hba基因突变。
83、在一个实施方案中，所述方法用于同时直接检测hba基因区域和长连锁片段的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁且是不依赖于先证者的pgt-m检测。
84、在一个具体的实施方案中，所述方法的长片段测序选自pacbio公司的smrt测序或ont公司的nanopore测序。
85、本发明第六方面还提供了一种不依赖于先证者的单体型连锁构建方法，其包括：
86、（1）获得父母样本和囊胚样本；
87、（2）采用如权利要求1-6中任一项所述的引物组或如权利要求7-13所述的试剂盒对所述父母样品和囊胚样本分别进行多重长片段pcr扩增，其中扩增产物包含 hba基因区域至少1个片段和 hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段；
88、（3）构建长片段测序文库并测序；
89、（4）根据所述父母样品和囊胚样本的 hba基因区域的突变和 hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域snp位点构建单体型连锁；
90、其中，所述方法仅对父母样品和囊胚样本进行多重长片段pcr扩增。
91、在一些实施方案中，所述 hba基因区域至少1个片段和 hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段包含以下的一种或多种突变： hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；其中所述点突变和所述结构变异包含来自ithanet、hbvar、lovd和lovd-china四个地中海贫血数据库收录的 hba基因突变；优选地，所述结构变异包含大片段缺失；更优选地，所述大片段缺失包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6。
92、本发明第七方面提供了一种联合父母样本检测人类胚胎α-地中海贫血的系统，其包括以下模块：
93、（1）采集模块：用于获得父母样本和囊胚样本；
94、（2）扩增模块：用于多重长片段pcr扩增，采用如权利要求1-6中任一项所述的引物组或如权利要求7-13所述的试剂盒对所述父母样品和囊胚样本分别进行多重长片段pcr扩增，其中扩增产物包含 hba基因区域至少1个片段和 hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段；
95、（3）文库构建模块：用于构建长片段测序文库；
96、（4）测序模块：用于测序；
97、（5）分析模块：用于胚胎致病分析，根据所述父母样品和囊胚样本的 hba基因区域的突变和 hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域snp位点构建单体型连锁并分析胚胎是否致病；
98、其中，所述系统仅对父母样品和囊胚样本进行多重长片段pcr扩增。
99、在一些实施方案中，所述 hba基因区域至少1个片段和 hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段包含以下的一种或多种突变： hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；其中所述点突变和所述结构变异包含来自ithanet、hbvar、lovd和lovd-china四个地中海贫血数据库收录的 hba基因突变；优选地，所述结构变异包含大片段缺失；更优选地，所述大片段缺失包括--sea、-α3.7、-α4.2、--thai、--fil、-α-9.7、--11.1、5.3kb_缺失、--brit、--cant、--geo、--js、--med-ii、--nor、钦州型缺失、--sa、--span、--thai、-α0.8、-α1.2、-α2.4、-α2.7、-α2.8、-α20.5、-α3.5、-α3.7、-α5.2和-α5.6。
100、在一些实施方案中，所述测序模块利用选自基于单分子实时测序smrt和纳米孔nanopore技术平台。
101、在一些实施方案中，所述扩增模块还用于对囊胚样本进行全基因组扩增。
102、基于长片段pcr扩增和长片段高通量测序特定组合的本发明可高特异性地、准确和快速地实现同时检测多个胚胎样本α-地中海贫血的多种突变。
103、除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。
104、定义
105、在本发明中，术语“ hba基因”是指一组在人类和其他哺乳动物中编码α-珠蛋白的基因。其中hba1基因位于16号染色体上，编码成人α-珠蛋白，hba2基因也位于16号染色体上，与hba1非常接近，编码另一种α链，通常在胎儿期表达较多。这些基因的突变或异常表达可以导致一系列疾病，例如α-地中海贫血症，而α-地中海贫血症则通常与α链的基因缺失或非功能性有关。
106、在本发明中，术语“连锁”是指两个或多个基因座在遗传过程中倾向于一起被传递给后代的现象。这种现象通常发生在染色体上物理距离较近的基因之间。
107、在本发明中，术语“snp”、“单核苷酸多态性”或“snp位点”、“单核苷酸多态性位点”可互换使用，其是指基因组水平上由单个氨基酸的变异所引起的dna序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。
108、在本发明中，术语“结构变异”是指核酸序列中相邻的至少两个碱基，优选至少四个碱基改变的结构变异，并且可以指例如多个核苷酸的缺失、插入、取代、序列的重复、或者序列的易位。根据某些实施方案，结构变异影响至少约50个碱基、优选至少约100个碱基、更优选至少约1kb(＝1000个碱基)的序列长度。根据某些实施方案，结构变异影响至多300mb(兆碱基＝1000000个碱基)，例如至多30mb，例如至多3mb的序列长度。
109、本发明中，“样本”可以是父母样本或囊胚样本。所述父母样本可以来源于血液、口腔拭子、毛发、尿液、唾液、粪便、关节液、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液等。所述囊胚样本可以是囊胚滋养层细胞。pgt技术首先要获得胚胎的遗传物质，常用的是囊胚滋养层细胞。受精后的第5-6天，胚胎发育至囊胚阶段时，大约有100-150个细胞，获取5~10个滋养层细胞用于遗传学检测。
110、在本发明中，术语“单体型”是指个体在某一染色体上的一系列紧密连锁的基因座上的等位基因组合。在遗传学中，单体型通常用来描述特定基因座上的一组等位基因，这些等位基因在遗传上是作为一个整体被传递的。
111、在本发明中，术语“先证者”指确诊为携带某致病基因，并表现出该疾病症状的患者，且其是与受试者具有遗传关系的生物体。
112、在本发明中，ithanet、hbvar、lovd和lovd-china是四个专注于地中海贫血症的数据库，它们提供了有关该疾病的遗传信息和相关数据。ithanet是一个国际性的数据库，由世界卫生组织（who）支持，旨在收集和分享有关地中海贫血症的遗传变异信息。它是一个多民族、多国家的项目，包含了广泛的遗传数据，有助于研究者了解不同人群中地中海贫血症的遗传背景。hbvar数据库是一个公开的、专业的数据库，专注于血红蛋白变异，包括地中海贫血症相关的变异。它提供了详细的变异信息，包括基因序列变化、相关的表型和文献引用，是研究血红蛋白病的重要资源。lovd是一个开放的变异数据库，由荷兰莱顿大学医学中心开发。它允许研究者提交和分享有关遗传变异的数据。lovd包含多个子数据库，涵盖不同的遗传疾病，包括地中海贫血症。lovd-china是lovd的一个分支，专注于中国人群的遗传变异。它提供了中国人群中地中海贫血症和其他遗传性疾病的变异信息，有助于了解中国人群的遗传特点和疾病风险。
113、本发明的优异技术效果主要在于以下几个方面：
114、（1）不依赖于先证者。本发明可以直接同时检测 hba基因区域及长连锁片段区域的单体型，并结合父母基因型进行连锁分析，避免了必须需要先证者的问题。
115、（2）多种突变类型单个试剂盒检测。本发明在一个反应引物体系里同时检测多种突变，包括snvs、indels、结构变异。
116、（3）高灵敏度和低成本。本发明能高效利用snp位点进行分型，大大提高胚胎基因型检测的简易性，大大地提高灵敏度和准确性，防止扩增等位基因脱扣造成的检测误诊，以及大大降低检测的时间成本和人力成本。
117、（4）高通量检测。长片段测序可实现384种barcode接头，实际还可以根据需要设计更多种barcode接头。或者利用引物带barcode和接头带barcode的双barcode系统实现更多种barcode组合。长片段测序平台的高通量特性决定可以实现高通量样品检测。
118、（5）精确度高。pacbio公司的smrt哑铃状文库在测序时可进行多轮解读，矫正后测序结果碱基精确度大于99%。而且smrt测序错误是随机的，再通过测序深度矫正碱基精确度大于99.9%。因此可以精确解读引物检测范围内的基因突变。
119、（6）检测时间灵活。nanopore平台可在数分钟内产生数据，可根据实际数据量需求在数分钟或数小时内开启数据分析。当对检测时效要求比较高时，nanopore平台具有时间优势。
1.一种引物组，其用于同时扩增hba基因区域的多种突变及其上下游1mb范围内连锁的单核苷酸多态性（snp）位点，
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；
3.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组用于同时扩增hba基因区域至少1个片段和hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段。
4.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物的扩增片段大小为1k至20kb。
5.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组用于同时直接检测hba基因区域和hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁，且所述检测不依赖于先证者。
6.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物的5’端还包含dna条形码；优选地，所述dna条形码是不同的且其长度为5-50nt。
7.权利要求1-6中任一项所述的引物组在制备用于检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的试剂盒中的应用。
8.一种用于检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的试剂盒，其包括以下试剂：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于同时直接检测hba基因区域和hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁，且所述检测不依赖于先证者。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述用于多重长片段pcr扩增的试剂还包括dna聚合酶、反应缓冲液和引物。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述用于构建长片段测序文库的试剂包括接头、连接酶、dna纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。
13.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述长片段测序选自基于单分子实时测序smrt和纳米孔nanopore技术平台。
14.一种检测人类胚胎α-地中海贫血多种突变的系统，其包括以下模块：
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述系统用于同时直接检测hba基因区域和hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域的单体型，所述检测利用囊胚和父母样本推断单体型连锁，且所述检测不依赖于先证者。
16.根据权利要求14所述的系统，其中所述系统用于同时检测以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；
17.根据权利要求15所述的系统，其中所述测序模块利用选自基于单分子实时测序smrt和纳米孔nanopore技术平台。
18.一种不依赖于先证者的单体型连锁构建方法，其包括：
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述hba基因区域至少1个片段和hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段包含以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；
20.一种联合父母样本检测人类胚胎α-地中海贫血的系统，其包括以下模块：
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述hba基因区域至少1个片段和hba基因区域上下游1mb范围内连锁区域4个片段包含以下的一种或多种突变：hba1/2基因位点引物范围内的点突变、结构变异以及上下游1mb范围内连锁的snp位点；
22.根据权利要求20所述的系统，其中所述测序模块利用选自基于单分子实时测序smrt和纳米孔nanopore技术平台。
23.根据权利要求20所述的系统，其中所述扩增模块还用于对囊胚样本进行全基因组扩增。
