本发明属于基因检测，尤其涉及crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法。
背景技术：
1、近年来，转基因作物的大规模应用引起了社会的广泛关注，转基因作物的市场监管对于确保粮食安全和生物安全至关重要。传统转基因检测方法普遍存在检测条件苛刻、花费昂贵或检测耗时长、灵敏度有待提高等问题，因此亟待开发用于转基因快速、高灵敏、特异性的检测技术。此外，对于转基因玉米而言，不仅要确定是否为转基因产品，更为希望得知是来自哪个厂家的转基因产品。因此，建立可以实现转基因作物多重检测的方法非常必要。
2、簇状规则间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关核酸酶(cas)具有基因识别、编辑功能。cas9是一种核糖核酸(rna)依赖的核酸内切酶，可顺式切割捕获的双链脱氧核糖核酸序列(dsdna)。crispr/cas9系统由sgrna(全称为single guide rna)和cas9组成，它们共同形成核糖核蛋白(rnp)复合物。sgrna包括成熟的crispr/rna(crrna)和转导的crispr/rna(tracrrna)。tracrrna通过碱基配对与部分crrna序列结合形成sgrna(crrna:tracrrna)。sgrna通过另一部分crrna序列与目标dna位点的碱基配对，引导cas蛋白复合物在目标位点结合，然后对该位点进行切割。cas9蛋白识别的原间隔邻近基序(pam)序列为5'-ngg-3'，其中n表示任意碱基。如果在dsdna上存在pam序列，并且sgrna成功结合到目标位点，cas9将在pam序列上游约3-4个核苷酸处进行dsdna切割。除了利用cas9蛋白的酶促裂解活性外，酶促失活的cas9(dcas9蛋白)仅具有序列特异性结合能力，不具备切割能力，也是一个很好的基因识别元件。
3、拉曼光谱是一种分子指纹光谱，光谱谱峰多且窄。根据物质的拉曼光谱轮廓不同，可以作为一种光谱编码策略。与常用的荧光编码技术相比，拉曼光谱由于谱峰窄的特点可实现多种编码且在编码信号读取时不易发生信号串扰，因此会在可见-近红外光波段比荧光编码产生更多的编码可能性，因此拉曼编码更适合于进行多重目标蛋白检测。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，包括以下步骤：
4、步骤1：针对三种转基因玉米mon810-cry1ab、mon810-vip3aa99和大北农-vip3aa的核酸序列(1、2、3)，筛选出亲和性佳的三条sgrna，分别为sgrna1(4)、sgrna2(5)和sgrna3(6)，sgrna中的crrna部分是由可与目标dna序列通过碱基配对进行特异性结合的20个核苷酸组成；
5、步骤2：将三份1μl 0.5μg/μl的dcas9蛋白溶液(7)分别与0.8μl 1μg/μl的sgrna1(4)、sgrna2(5)、sgrna3(6)溶液混合，室温孵育10min，获得dcas9-sgrna1(8)、dcas9-sgrna2(9)、dcas9-sgrna3(10)的蛋白-核酸复合物溶液；
6、步骤3：利用三种磁性聚合物微球(11、12、13)表面的羧基和dcas9蛋白表面的氨基进行缩合反应形成酰胺键，将dcas9-sgrna1(8)、dcas9-sgrna2(9)、dcas9-sgrna3(10)分别修饰在三种磁性聚合物微球(11、12、13)表面，形成三种dcas9-sgrna复合的磁性聚合物球探针(14、15、16)；之后进行磁分离，清洗两次；
7、步骤4：将步骤3获得的三种dcas9-sgrna复合的磁性聚合物球探针(14、15、16)按1:1:1体积比混合，获得混合探针溶液(17)；
8、步骤5：将2-10μl待测玉米样品(叶片或籽粒)的核酸提取液(18)加入到20μl步骤4获得的混合探针溶液(17)中，获得反应液(19)，将反应液(19)在37℃下反应30min，之后对反应液(19)进行磁分离，并用纯净水洗涤两次后用20μl水重新分散探针；
9、在步骤5中，若待测玉米样品的核酸提取液(18)中存在三种目标核酸基因链段(1、2、3)，则被捕获富集到相应探针(14、15、16)的表面，将在反应液(19)中获得目标基因-探针复合的微球(20、21、22)；
10、步骤6：在步骤5得到的溶液中加入荧光染料，继续孵育一定时间，再进行磁分离，洗涤两次；
11、在步骤6中，若待测玉米样品的核酸提取液(18)中存在三种目标核酸基因链段(1、2、3)，荧光染料将插入到目标基因-探针复合的微球(20、21、22)上的目标核酸链段(1、2、3)；
12、步骤7：将步骤6得到的目标基因-探针复合的微球(20、21、22)放置在荧光显微镜下进行观察；
13、若存在荧光明亮的微球，则存在mon810-cry1ab、mon810-vip3aa99和大北农-vip3aa转基因玉米的目标基因(1、2、3)中的一种或多种；若无荧光明亮的微球，则不存在；
14、步骤8：对步骤7中获得的荧光明亮的目标基因-探针复合的微球(20、21、22)进行显微拉曼光谱采集，获得拉曼光谱信号；
15、在步骤8中，阳性样本判别原则如下：
16、若与微球(11)信号对照一致，则mon810-cry1ab转基因样本(1)阳性；
17、若与微球(12)信号对照一致，则mon810-vip3aa99转基因样本(2)阳性；
18、若与微球(13)信号对照一致，则大北农-vip3aa转基因样本(3)阳性。
19、进一步的，所述磁性聚合物微球为核壳结构，内部核为具有磁性的fe3o4纳米粒子，其磁性可以保证在步骤3、步骤5、步骤6通过磁分离方式方便除去未结合的dcas9蛋白(7)、荧光染料以及提取核酸样本(18)；外壳层为聚苯乙烯(ps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚丙烯腈(pan)、聚乙烯醇(pva)等拉曼光谱信号强、光谱特征可互相区分的高分子聚合物，用于拉曼光谱编码；外壳层的最外层表面为羧基化表面，用于固定dcas9蛋白；磁性聚合物微球的粒径为1-50μm。
20、进一步的，所述sgrna1的crrna序列结构为以下三条序列段中的一种：
21、gcaugcuaguaaucuuuggg；
22、uuaacgaccucaucgcucag；
23、ugagauuccccugagcgaug；
24、所述sgrna2的crrna序列结构为以下三条序列段中的一种：
25、caggccaaagccguugaucg；
26、aagcugaucgugccaccgag；
27、cggcuucaucagcaacaucg；
28、所述sgrna3的crrna序列结构为以下三条序列段中的一种：
29、uagcguagcgaauccugacg；
30、caauuccacaccuccaucga；
31、auugccggaauugaacacgu。
32、进一步的，所述荧光染料为亚甲基蓝或sybrtm green i，当荧光染料为亚甲基蓝时，继续孵育120min；当荧光染料为sybrtm green i时，继续孵育10min。
33、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
34、1、本发明将crispr/dcas9与拉曼编码技术相结合用于转基因农作物的多重检测，可以同时区分不同厂家的转基因品类，拓宽了crispr体系单一检测的限制。
35、2、本发明中，dcas9蛋白具有序列特异性结合能力可保障该检测方法的灵敏度和特异性，拉曼编码与荧光编码技术相比具有更多的编码可能性。因此该检测方法能够高效、精准地检测转基因序列，具有操作简单的优点，对转基因作物的监管具有重要意义。
1.crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，其特征在于，所述磁性聚合物微球为核壳结构，内部核为具有磁性的fe3o4纳米粒子，外壳层为具有一定强度的拉曼光谱信号且光谱特征可互相区分的高分子聚合物，用于拉曼光谱编码；外壳层的最外层表面为羧基化表面，用于固定dcas9蛋白；磁性聚合物微球的粒径为1-50μm。
3.根据权利要求1所述的crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，其特征在于，所述sgrna1的crrna序列结构为以下三条序列段中的一种：
4.根据权利要求1所述的crispr/dcas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，其特征在于，所述荧光染料为亚甲基蓝或sybrtm green i，当荧光染料为亚甲基蓝时，继续孵育120min；当荧光染料为sybrtm green i时，继续孵育10min。
