本发明属于分子生物学，具体涉及一种用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组和应用。
背景技术：
1、星状病毒是一种无包膜的单股正链rna病毒，因病毒颗粒表面带有5-6个星尖状的突起，类似星形，因此得名。星状病毒基因组长度从6.8kb到7.9kb不等，根据完整的orf2的遗传差异和宿主范围来区分星状病毒的基因型和种类。星状病毒基因组的结构包含5′和3′端的非编码区，3′端非翻译区poly（a）尾和3个开放阅读框orf1a、orf1b和orf2。其中orf1a和orf1b编码非结构蛋白，org2编码衣壳蛋白。截止到2019年，国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses, ictv)将星状病毒科分成2个病毒属，即哺乳动物星状病毒属(mamastrovirus)和禽星状病毒属(avastrovirus)。
2、2020年本实验室通过宏基因组学的方法首次从小熊猫的肠道组织和粪便中检测出小熊猫源星状病毒（red panda astrovirus，rpastv），包括rpastv-1（genbank:mz357116.1）和rpastv-2（genbank:mz357117）两种病毒分离株。通过系统发育树分析，小熊猫星状病毒的两种病毒株分别与猫星状病毒和猪星状病毒具有亲缘关系。目前，圈养小熊猫种群数量不断增加，与人类接触越发密切，增加了某些流行病跨物种传播对可能性。而且随着对星状病毒研究不断深入，越来越多的证据表明星状病毒具有成为人畜共患病的潜力。
3、星状病毒可以感染多种禽类动物，如鸡、鸭、鹅等，也能使人、猪、猫、狗、水貂、老虎等哺乳动物染病。感染星状病毒的动物表现为水样腹泻，部分动物可能会引起脑炎、脑膜炎，严重危害动物的种群健康。2020年首次在小熊猫的组织和粪便样品中发现了星状病毒，表明该病毒可能会在小熊猫种群传播。
4、目前，星状病毒的的检测方法主要有：rt-pcr法，实时荧光定量pcr法、病毒分离法、电镜检查法、免疫学检测法。其中病毒分离法需要严格的实验环境，电镜检查法需要特定的仪器设备且不适合大规模的种群筛查，免疫学检测法操作繁琐且灵敏度较低，rt-pcr法耗时较长。并且，现有星状病毒的检测方法主要针对鸡、鸭、鹅、猪等经济动物，由于感染这些宿主的星状病毒基因序列与小熊猫星状病毒基因序列差异较大，无法使用现有的检测方法对小熊猫星状病毒进行检测。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组和应用，本发明通过分析小熊猫星状病毒的基因组信息，设计特异性的引物和探针，通过对反应体系和反应程序的不断优化，提供一种灵敏、准确、快速的小熊猫星状病毒rpastv-1和rpastv-2的双重实时荧光定量pcr检测方法，填补了目前小熊猫星状病毒检测方法的空缺，为圈养小熊猫和小熊猫栖息地疫源疫病监测提供技术支撑。
2、本发明根据两种小熊猫源星状病毒株rpastv-1和rpastv-2的基因序列，分别设计了一对特异性引物和一条对应taqman探针。通过优化反应体系和反应程序，筛选得到最适的荧光pcr反应条件。在最适反应条件下，验证该方法的检测特异性、灵敏度性和重复性均符合要求，建立了一种能同时检测rpastv-1和rpastv-2的双重荧光定量pcr检测方法。本发明可根据实时荧光pcr扩增曲线的有无，判断待测样品中是否含有小熊猫星状病毒的分子信息，实现小熊猫星状病毒的快速检测。
3、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
4、一种检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组和应用，包括特异性引物和探针；特异性引物的序列如下：
5、rpastv-1 f：5’-agcgggtggattcccttgtctat-3’；
6、rpastv-1 r：5’-caggcttgacccacattccaaa-3’；
7、rpastv-2f：5’-ctcctaacccgctatgtgcttatg-3’；
8、rpastv-2 r：5’-ccatgcagttatctggtgttgttg-3’；
9、探针的序列如下：
10、rpastv-1 probe：5’-aggctgacgacctttccatcagtgcca-3’；
11、rpastv-2 probe：5’-acctcggcgttggatggtcacctcac-3’。
12、进一步地，在探针序列的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。
13、进一步地，荧光基团为hex、fam、joe、tet或fitc；猝灭基团为bhq1、bhq-2、bhq-3或dabcyl。
14、进一步地，荧光基团为hex或fam，猝灭基团为bhq1。
15、上述用于检测检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组在制备检测小熊猫源星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
16、一种用于检测小熊猫源星状病毒的试剂盒，包括上述的引物组。
17、上述用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组，或试剂盒在非诊断目的的rt-pcr扩增小熊猫源星状病毒中的应用。
18、进一步地，rt-pcr的反应体系为：ssoadvanced universal probes supermix（2x）预混酶10μl、引物探针终浓度分别设置为300mol/μl和200mol/μl、cdna/dna1μl，最后用ddh2o补至20μl。
19、进一步地，rt-pcr的反应程序为：95℃、3min，95℃、10s，60℃、30s，40个循环。
20、本发明还提供了一种小熊猫源星状病毒rpastv-1和rpastv-2的双重实时荧光定量pcr检测方法，具体如下：
21、（1）收集序列，设计引物、探针
22、通过ncbi检索，获得已发表的rpastv-1（登录号：mz357116.1）和rpatsv-2（登录号：mz357117.1）的基因核苷酸序列。分析上述核苷酸序列，根据高保守区域，分别设计了一对特异性引物和一条对应的taqman探针，具体序列如seq id no.1~6所示。引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
23、（2）样本检测
24、提取待测样本中病毒的rna，逆转录得到cdna作为模板，采用特异性引物探针组合在最适条件下进行实时荧光定量pcr，根据pcr扩增曲线的有无，实现待测样本中星状病毒的检测。
25、本发明的有益效果：
26、1、本发明填补了小熊猫星状病毒检测方法的空缺，且能够同时快速、准确检测小熊猫可能感染的两种星状病毒毒株，有利于保护该种健康发展。
27、2、通过宏基因组发现小熊猫感染的星状病毒包括rpastv-1和rpastv-2两种基因型，且有研究表明星状病毒常与轮状病毒、诺如病毒、细小病毒、冠状病毒等混合感染个体。因此需要一种特异、灵敏、快速的检测方法。查阅相关文献及专利，现有星状病毒检测方法主要用于对猪、鸭、鹅等动物的检测。其中仅猪星状病毒就有五种基因型，且彼此基因型序列差异很大。通过比对分析，现有星状病毒检测方法的引物不能完全适配两种小熊猫星状病毒基因序列，且现有检测方法主要以普通pcr方法为主，相较于实时荧光pcr方法，无法满足同时快速、灵敏检测两种小熊猫星状病毒。
28、因此，本发明针对小熊猫星状病毒rpastv-1和rpastv-2两种基因型，分别设计特异性的引物探针，通过不断优化pcr反应条件，构建了一种能够同时检测两种小熊猫星状病毒毒株的双重实时荧光pcr特异性检测方法，其针对小熊猫星状病毒具有优异的特异性和灵敏度，对保护小熊猫群体的健康发展和生态群落的稳定，具有良好的应用前景。
1.一种用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组，其特征在于，包括特异性引物和探针；
2.根据权利要求1所述的用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组，其特征在于，在探针序列的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组，其特征在于，荧光基团为hex、fam、joe、tet或fitc；猝灭基团为bhq1、bhq-2、bhq-3或dabcyl。
4.权利要求1~3任一项所述的用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组在制备检测小熊猫源星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种用于检测小熊猫源星状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的引物组。
6.权利要求1~3任一项所述的用于检测小熊猫源星状病毒的双重荧光定量pcr引物组，或权利要求5所述的试剂盒在非诊断目的的rt-pcr扩增小熊猫源星状病毒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述rt-pcr的反应体系为：2xssoadvanced universal probes supermix预混酶10μl、引物探针终浓度分别设置为300mol/μl和200mol/μl、cdna/dna1μl，最后用ddh2o补至20μl。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述rt-pcr的反应程序为：95℃、3min，95℃、10s，60℃、30s，40个循环。
