本发明涉及医学领域，特别是，本发明涉及用于大规模选择性产生人vδ1+γδt细胞的新的且有效的方法，其对于在癌症的过继免疫疗法中临床应用来说是最佳的。
背景技术：
1、mhc(主要组织相容性复合体)差异造成的障碍通常限制了过继t细胞疗法的使用。因此，目前t-细胞产品如表达嵌合抗原受体(car)的t细胞(car-t)的临床应用依赖于逐个病例的自体t细胞产生。然而，患者t细胞通常由于持续施用攻击性药物治疗而功能受损。此外，个性化定制的自体t细胞生产过程限制了t细胞在特定肿瘤类型(如t细胞肿瘤)中的广泛应用。因此，需要通用的同种异体t细胞来制备可作为用于大规模临床应用的“现成(off-the-shelf)”即用型治疗剂的t细胞产品。
2、最近，γδt细胞已成为αβt细胞用于细胞免疫疗法的替代品，因为它们不受肿瘤相关肽的mhc呈递的限制，并且显示出有限的同种异体潜力。尽管如此，γδt细胞在病毒感染和肿瘤进展中发挥重要作用，提供稳健和持久的抗肿瘤反应(vantourout和hayday，natrev immunol.,2013；silva-santos等人，nat.rev.immunol.,2015)。特别是，vδ1+γδt细胞是癌症过继细胞疗法的非常有吸引力的候选者，因为它们通常在肿瘤浸润中占主导地位(超过vδ2+)，对激活诱导的细胞死亡不太敏感，并且可以作为肿瘤反应性淋巴细胞长期存在(siegers等人，mol.ther.2014)。然而，vδ1+γδt细胞，代表出生时普遍的γδt细胞的vδ1+t细胞亚型(morita等人，j.immunol.1994)，在外周血中稀少分布，并且合适的扩增/分化方法的缺乏已经排除了其治疗用途。在这种意义上，bruno silva-santos的小组最近开发了临床级方法，使用tcr激动剂和细胞因子来选择性扩增从外周血分离的细胞毒性vδ1t细胞(correia等人，blood 2011；almeida等人，clin.cancer res.2016)。名为δ1t(delta onet，dot)细胞的细胞产品在慢性淋巴细胞白血病(cll)的临床前模型中显示出治疗潜力，为其在癌症过继免疫疗法中的临床应用提供了原理论证。
3、尽管如此，可从外周血中分离的vδ1+t细胞的数量有限，强调了需要开发用于稳健产生/扩增细胞毒性vδ1+抗肿瘤t细胞的补充性方案。更重要的是，由于响应于外周免疫挑战(例如cmv)而发生克隆扩增(ravens等人，nature immunol.2017)，新生的vδ1+t细胞的分散的和多样性的t细胞受体(tcr)库在成年期变得非常有限并集中于少数优势克隆型(davey等人，nature commun.2016)。vδ1+细胞的克隆扩增导致从vδ1t细胞幼稚表型分化为以cd27下调为特征的vδ1t细胞效应/记忆表型(davey等人，trends immunol.2018)。由于人幼稚源性效应t细胞(human naive-derived effector t cell)保留较长的端粒，最能够体外扩增和t细胞受体转基因表达，并且已经与临床试验中的更大功效相关联，因此已经假定幼稚细胞抵抗终末分化或“耗竭”，维持高复制潜力，并且因此可以是用于过继免疫疗法的更优越的亚群(hinrichs等人，blood2011)。
技术实现思路
1、本发明为解决上述问题而做出，其目的涉及用于大规模选择性产生人vδ1+γδt细胞、优选同种异体人vδ1+γδt细胞的新的且有效的方法，其对于在癌症的过继免疫疗法中临床应用来说是最佳的。在这种意义上，考虑到本发明的发现，即目前在临床上被选为造血干细胞来源的人脐带血cd34+造血干/祖细胞(hpc)和人cd34+早期胸腺祖细胞(earlythymic progenitor，etp)都可以响应notch信号传导而有效地从头产生人vδ1+γδt细胞，因此，本发明的方法包括通过用jag2 notch配体激活人hpc(优选脐带血cd34+hpc)和/或人cd34+etp以诱导它们分化，其中所述配体在骨髓来源的基质细胞系的表面上过表达。优选地，该方法包括将人hpc(优选脐带血cd34+hpc)或人cd34+etp在过表达jag2的基质细胞(优选补充有flt3+scf+il-7)上共培养长达9周。然后，如上所述以notch依赖性tcr非依赖性方式产生的vδ1+γδt细胞(步骤1)，将按照本领域已知的在tcr激活时诱导vδ1+γδt细胞增殖的任何方法，如通过使用抗cd3 mab和包括il-4、ifn-γ和il-15在内的细胞因子(almeida等人，clin.cancer res.2016)，进行激活和扩增(步骤2)。
2、
技术实现要素：
3、本发明涉及从包含人hpc(如cd34+脐带血hpc)和/或人etp的细胞群体中从头产生notch诱导并分化的cd1a-vδ1+γδt细胞的扩增群体的体外方法，该方法包括产生包含比αβt细胞更高量的γδt细胞的细胞组合物的第一步骤，第一步骤包括：
4、a.在包含jag2 notch配体或其激动剂的充足培养基中培养包含hpc和/或etp的细胞群体；以及
5、b.将培养物中的细胞维持足以产生γδt细胞的一段时间，优选地该段时间为约2周至约15周，并且jag2 notch配体或激动剂应当在培养时而且在整个培养期间以充足的量存在在或添加至细胞的所述培养物中，
6、其中，由第一步骤得到的细胞组合物的特征在于其包含cd1a-vδ1+γδt细胞，并且其中该方法还包括激活并诱导所述cd1a-vδ1+γδt细胞的增殖的第二步骤，第二步骤包括在yδtcr激动剂存在下和在至少il21和il15存在下，在充足培养基中培养第一步骤后获得的细胞以获得细胞群体，该细胞群体的特征在于总γδt细胞的至少40％是扩增和激活的cd1a-vδ1+γδt细胞，并且其中cd1a-vδ1+γδt细胞群体的特征在于：
7、-vδ1+γδt细胞总数的至少40％、优选地至少50％或60％表达cd56标志物，
8、-vδ1+γδt细胞总数的至少60％、优选地至少70％或80％表达nkp44标志物，
9、-vδ1+γδt细胞总数的至少60％、优选地至少70％或80％表达nkp30标志物，
10、-vδ1+γδt细胞总数的至少70％、优选地80％-100％表达nkg2d标志物，以及
11、-vδ1+γδt细胞总数的至少80％、优选地90％-100％表达dnam-1标志物，
12、其中上述标志物的表达水平优选地通过流式细胞术测量。
13、优选地，第二步骤包括：
14、-在至少一种yδtcr激动剂和至少il21存在下，在充足培养基中培养在第一步骤之后获得的细胞5天，以及
15、-在第5天、优选地在第7天，将il15添加至培养基中，并在至少一种yδtcr激动剂、il21和il15存在下培养细胞至少7天。
16、优选地，至少一种yδtcr激动剂以0.5μg/ml-4μg/ml的浓度添加，il21以7ng/ml-15ng/ml的浓度添加，以及il15以70ng/ml-150ng/ml的浓度添加。
17、优选地，人hpc是cd34+脐带血hpc。
18、优选地，在第二步骤后获得的激活的cd1a-vδ1+γδt细胞的特征还在于它们表达cd25和/或cd69激活标志物，但不表达lag3和/或ctla4耗竭标志物。
19、优选地，在第二步骤后获得的激活的cd1a-vδ1+γδt细胞的特征在于表达cd8标志物并且具有t效应表型，其中t效应表型的特征在于cd45ra的表达并且缺乏cd62l标志物的表达。
20、本发明还提供了细胞组合物，其包含在上述方法的第二步骤后获得或可获得的从头notch诱导并分化的cd1a-vδ1+γδ。优选地，激活的vδ1+γδt细胞的特征在于：
21、-vδ1+γδt细胞总数的至少40％、优选地至少50％或60％表达cd56标志物，
22、-vδ1+γδt细胞总数的至少60％、优选地至少70％或80％表达nkp44标志物，
23、-vδ1+γδt细胞总数的至少60％、优选地至少70％或80％表达nkp30标志物，
24、-vδ1+γδt细胞总数的至少70％、优选地80％-100％表达nkg2d标志物，以及
25、-vδ1+γδt细胞总数的至少80％、优选地90％-100％表达dnam-1标志物，
26、其中上述标志物的表达水平优选地通过流式细胞术测量。
27、本发明还提供了在上文定义的方法的第一步骤之后获得或可获得的包含比αβt细胞更高量的γδt细胞的细胞组合物。优选地，细胞组合物的特征在于，在第一步骤后产生的vδ1+γδt的群体依次包含：
28、a.第一细胞群体(cd1a+vδ1+γδt细胞)，其特征在于，它们表达未成熟表面细胞标志物cd1a，以及
29、b.第二细胞群体(cd1a-vδ1+γδt细胞)，其特征在于，它们不表达未成熟表面细胞标志物cd1a。
30、优选地，第一细胞群体的特征在于细胞不表达表面细胞标志物cd25、cd27、nkp44、nkp30和nkg2d。优选地，第二细胞群体的特征在于细胞表达表面标志物cd27、cd73、cd69、nkp44、nkp30和nkg2d中的至少一种或至少两种或更多种的组合、优选全部。
31、本发明还提供了使用上文定义的细胞组合物获得或可获得的car t细胞。
32、本发明还提供了药物组合物，其包含上文定义的细胞组合物或car t，并且还包含药学上可接受的药剂或载剂。
33、本发明还提供了用于疗法用途的如上定义的药物组合物。优选地，该用途用于细胞疗法、肿瘤或癌症治疗、肿瘤或癌症免疫疗法和/或白血病治疗。
1.一种从包含人hpc如cd34+脐带血hpc和/或人etp的细胞群体从头产生notch诱导并分化的cd1a-vδ1+γδt细胞的扩增群体的体外方法，所述方法包括产生包含比αβt细胞更高量的γδt细胞的细胞组合物的第一步骤，所述第一步骤包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二步骤包括：
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述至少一种yδtcr激动剂以0.5μg/ml-4μg/ml的浓度添加，il21以7ng/ml-15ng/ml的浓度添加，以及il15以70ng/ml-150ng/ml的浓度添加。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述人hpc来源于cd34+脐带血hpc。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在所述第二步骤后获得的激活的cd1a-vδ1+γδt细胞的特征还在于它们表达cd25和/或cd69激活标志物，但不表达lag3和/或ctla4耗竭标志物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在所述第二步骤之后获得的激活的cd1a-vδ1+γδt细胞的特征在于表达cd8标志物并且具有t效应表型，其中所述t效应表型的特征在于cd45ra的表达并且缺乏cd62l标志物的表达。
7.一种细胞组合物，其包含在权利要求1至6中任一项所述的方法的第二步骤后获得或能够获得的从头notch诱导并分化的cd1a-vδ1+γδ。
8.一种细胞组合物，其包含从头notch诱导并分化的cd1a-vδ1+γδt，其中激活的vδ1+γδt细胞的特征在于：
9.一种细胞组合物，其包含比αβt细胞更高量的γδt细胞，所述细胞组合物在根据权利要求1至6中任一项所述方法的第一步骤后获得或能够获得。
10.根据权利要求9所述的细胞组合物，其特征在于，在第一步骤后产生的vδ1+γδt群体依次包含：
11.根据权利要求10所述的细胞组合物，其中，所述第一细胞群体的特征在于所述细胞不表达表面细胞标志物cd25、cd27、nkp44、nkp30和nkg2d。
12.根据权利要求9或10所述的细胞组合物，其中，所述第二细胞群体的特征在于所述细胞表达表面标志物cd27、cd73、cd69、nkp44、nkp30和nkg2d中的至少一种、或至少两种或更多种的组合、优选全部。
13.一种car t细胞，其使用权利要求7-12中任一项所述的细胞组合物获得或能够获得。
14.一种药物组合物，其包含权利要求7-12中任一项所述的细胞组合物或权利要求13所述的car t细胞，并且还包含药学上可接受的药剂或载剂。
15.用于疗法用途的根据权利要求14所述的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其用于细胞疗法、肿瘤或癌症治疗、肿瘤或癌症免疫疗法和/或白血病治疗的用途。
