本发明属于生物，特别涉及一种利用引物的熔解温度差特异性扩增smn1的引物组合物、方法、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是一种常染色体隐性遗传疾病，主要影响运动神经元，导致肌肉无力和萎缩。绝大多数sma由smn1基因发生突变引起。
2、目前sma诊断的主流技术是多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,mlpa)。mlpa是一种针对待检dna序列进行定性和半定量分析的技术。mlpa反应首先利用两个寡核苷酸探针和靶序列dna进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。在mlpa反应中，只有两个探针序列与靶序列完全杂交，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链。连接反应完成后，用引物扩增连接好的探针，并通过电泳分离扩增产物，最后分析并得出结论。如果检测的靶序列发生点突变或拷贝数变异，那么相应的扩增产物便会缺失或变化。根据扩增产物的改变判断靶序列是否有点突变拷或贝数的异常存在。
3、mlpa只能对smn1的大片段缺失或拷贝数异常进行诊断，无法对靶序列之外的区域中是否含有微小突变(如点突变等)进行诊断。约有5％的sma患者是由smn1的微小突变引起的，mlpa无法鉴别这部分患者。mlpa因试剂非国产化，其耗材贵、操作步骤较复杂和检测时间长，且对于人群中少见的“2+0”型携带者及点突变患者无法检出等缺点限制其在大规模携带者筛查中的应用；因此，若要检测smn1基因上的微小突变，势必要获得smn1全长序列，而smn1全长序列长度超过28kb，常规pcr程序无法完成扩增。利用长片段pcr可扩增大于5kb的dna片段，但是目标dna片段越长，扩增反应非特异性也会增加，从而增加长片段pcr的难度。
4、smn1和smn2基因高度同源，仅在外显子6到外显子8片段有5个碱基的区别，进一步给smn1的特异性扩增造成了困难。clermont o等人和kubo y等人分别公开了smn1长片段扩增技术，可用来检测smn1上的微小突变。
5、然而，他们的方法都会产生明显的非特异性扩增产物，影响检测结果的判断，同时使得扩增产物不能直接用于建库或巢式pcr，需要对产物进行纯化，使得smn1检测流程复杂。另一方面，clermont o等人的方法只能对smn1内含子1至外显子7的序列进行扩增，无法检测出smn1外显子1上的突变。
6、因此，开发一种特异性强、简单便捷、检测时间短、检测成本低的pcr扩增方法对于smn1的全长扩增及sma的诊断有重要意义。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种利用引物的熔解温度差特异性扩增smn1的引物组合物、方法、试剂盒及其应用。
2、本发明的目的之一是提供一种用于特异性扩增smn1的引物组合物，包括前引物和后引物，所述前引物针对smn1基因5’utr区设计，后引物针对smn1基因外显子8处特异性碱基设计；所述引物组合物通过所述前引物和后引物的熔解温度差异特异性扩增smn1。
3、所述前引物与相对于smn1的转录起始位点从-3102bp至-358bp的区域中的5’utr区的至少一部分序列互补；
4、所述后引物针对smn1和snm2外显子8上的差异性位点(c.*239g>a)进行设计；
5、所述前引物与后引物的熔解温度差为10.5℃～13℃中的任意值，所述后引物的熔解温度高于所述前引物的熔解温度；
6、优选的，所述前引物与后引物的熔解温度差为10.96℃、11℃、11.38℃、12.87℃、或13℃；
7、更优选的，所述前引物与后引物的熔解温度差为10.96℃、11.38℃、12.87℃；
8、更优选的，所述前引物与后引物的熔解温度差为12.87℃。
9、所述前引物序列长度为16-21bp，熔解温度f-tm为60℃～63℃；
10、所述后引物序列长度为25-31bp，熔解温度r-tm为70℃～76℃；
11、优选的，所述f-tm为60.85℃；所述r-tm为73.72℃；
12、优选的，所述f-tm为62.76℃，所述r-tm为73.72℃；
13、优选的，所述f-tm为62.34℃；所述r-tm为73.72℃；
14、进一步的，所述前引物序列如seq id no.3所示，所述后引物序列如seq id no.6所示；
15、进一步的，所述前引物序列如seq id no.4所示，所述后引物序列如seq id no.6所示；
16、进一步的，所述前引物序列如seq id no.5所示，所述后引物序列如seq id no.6所示；
17、进一步的，所述前引物和/或所述后引物存在修饰；
18、进一步的，所述前引物和/或所述后引物的修饰包括锁核酸修饰、肽核酸修饰；
19、优选的，所述前引物和/或所述后引物上有锁核酸修饰。
20、本发明的目的之二是提供一种利用引物熔解温度差特异性扩增smn1基因的方法，包括以下步骤：
21、s1.获取样品dna；
22、s2.对所述样品dna进行预处理；
23、s3.使用引物组合物对步骤s2获得的预处理后的样品dna进行pcr扩增，获得扩增产物，所述引物组合物包括前引物和后引物，并且所述引物组合物通过所述前引物和后引物的熔解温度差异特异性扩增smn1；
24、其中，所述步骤s3采用高退火温度和低退火温度交替循环的反应程序进行pcr扩增。
25、进一步的，所述步骤s1中的样品包括选自血液、血浆、全血、细胞、组织、尿液中的任意一种或多种样品；
26、进一步的，所述步骤s1中的样品dna为基因组dna；
27、进一步的，所述步骤s2中的dna预处理包括dna纯化；
28、优选的，所述步骤s2中的预处理为对dna进行柱纯化或磁珠法纯化；
29、优选的，所述步骤s3中样品dna的dna模版用量为100～300ng。
30、所述步骤s3中的高退火温度和低退火温度交替循环的反应程序包括m个从高退火温度到低退火温度的大循环，所述每个大循环包括n个小循环，其中，m为3～6中的任意整数，n为2～4中的任意整数；
31、所述每个小循环依次包括在t1温度下变性，在t2温度下退火，在t2或t3温度下延伸的步骤；
32、所述每个大循环中，每个小循环依次执行1次，并且每个小循环的退火温度高于下一个小循环的退火温度，其中，第1个小循环的退火温度为该大循环的初始退火温度，且所述初始退火温度为高退火温度，第n个小循环的退火温度为低退火温度；
33、所述引物组合物的后引物的熔解温度r-tm减去所述高退火温度的差值为-1～9℃范围内的任意值，所述低退火温度减去所述引物组合物的前引物的熔解温度f-tm的差值为-1～3℃范围内的任意值；
34、所述每个大循环重复执行2～6次后，再开始执行下一个大循环；
35、所述第1至第m-1个大循环中，每个大循环的初始退火温度高于下一个大循环的初始退火温度；
36、所述第1至第m-1个大循环中，所述每个小循环的所述变性温度t1为90～98℃，变性时间为10-30秒，所述退火温度t2和延伸温度t3相同，退火并延伸的时间为10-15分钟；
37、所述第m个大循环中的第1至第n-1个小循环的所述变性温度t1为90～98℃，变性时间为10-30秒，所述退火温度t2和延伸温度t3相同，退火并延伸的时间为10-15分钟；
38、所述第m个大循环中的第n个小循环的所述变性温度t1为90～98℃，变性时间为10-30秒，所述退火时间为10-30秒，所述延伸时间为10-15分钟，且所述延伸温度t3高于所述退火温度t2，所述退火温度t2与所述前引物的熔解温度f-tm的差值(t2-f-tm)为-1～2℃范围内的任意值；
39、优选的，在所述第1个大循环开始之前，包括预变性步骤；
40、优选的，在第m个大循环执行之后，还包括延伸，以及在20℃下保持的步骤。
41、优选的，所述步骤s3中的高退火温度和低退火温度交替循环的反应程序包括：
42、s3-1.94℃预变性2分钟；
43、s3-2.98℃变性10秒，71℃退火并延伸15分钟；
44、s3-3.98℃变性10秒，69℃退火并延伸15分钟；
45、s3-4.98℃变性10秒，62℃退火并延伸15分钟；
46、s3-5.按照所述s3-2、s3-3、s3-4的顺序重复执行2个循环；
47、s3-6.98℃变性10秒，69℃退火并延伸15分钟；
48、s3-7.98℃变性10秒，67℃退火并延伸15分钟；
49、s3-8.98℃变性10秒，62℃退火并延伸15分钟；
50、s3-9.按照所述s3-6、s3-7、s3-8的顺序重复执行2个循环；
51、s3-10.98℃变性10秒，67℃退火并延伸15分钟；
52、s3-11.98℃变性10秒，65℃退火并延伸15分钟；
53、s3-12.98℃变性10秒，62℃退火并延伸15分钟；
54、s3-13.按照所述s3-10、s3-11、s3-12的顺序重复执行2个循环；
55、s3-14.98℃变性10秒，68℃退火并延伸15分钟；
56、s3-15.98℃变性10秒，62℃退火30秒，再68℃延伸15分钟；
57、s3-16.按照所述s3-14、s3-15的顺序重复执行6个循环；
58、s3-17.68℃保温7分钟，降温至20度保持。
59、进一步的，所述方法还包括步骤s4.测序分析；
60、进一步的，所述步骤s4采用选自一代测序、二代测序、三代测序中的任意一种进行测序分析；
61、进一步的，所述一代测序包括sanger法；
62、进一步的，所述二代测序包括选自焦磷酸测序法、连接酶法、靶向区域测序、全外显子测序、全基因组测序、线粒体dna测序中的任意一种；
63、进一步的，所述三代测序包括选自纳米孔电信号测序、单分子荧光信号测序中的任意一种；
64、进一步的，所述步骤s4采用巢式pcr和sanger测序法对所述步骤s3扩增获得的所述扩增产物进行测序；
65、进一步的，所述步骤s4中的所述分析包括分析所述s3中获得的扩增产物是否具有微小突变；
66、进一步的，所述微小突变包括选自点突变、单核苷酸变异、单核苷酸多态性、插入/缺失、重复中的一种或多种。
67、本发明的目的之三是提供一种用于特异性扩增smn1的试剂盒，包括所述引物组合物，所述引物组合物包括前引物和后引物，所述前引物针对smn1基因5’utr区设计，后引物针对smn1基因外显子8处特异性碱基设计，所述引物组合物通过所述前引物和后引物的熔解温度差异特异性扩增smn1。
68、所述前引物与相对于smn1的转录起始位点从-3102bp至-358bp的区域中的5’utr区的至少一部分序列互补；
69、所述后引物针对smn1和snm2外显子8上的差异性位点(c.*239g>a)进行设计；
70、所述前引物与后引物的熔解温度差为10.5℃～13℃中的任意值，所述后引物的熔解温度高于所述前引物的熔解温度；
71、优选的，所述前引物与后引物的熔解温度差为10.96℃、11℃、11.38℃、12.87℃、或13℃；
72、更优选的，所述前引物与后引物的熔解温度差为12.87℃。
73、所述前引物序列长度为16-21bp，熔解温度f-tm为60℃～63℃；
74、所述后引物序列长度为25-31bp，熔解温度r-tm为70℃～76℃；
75、优选的，所述f-tm为60.85℃；所述r-tm为73.72℃；
76、优选的，所述f-tm为62.76℃，所述r-tm为73.72℃；
77、优选的，所述f-tm为62.34℃；所述r-tm为73.72℃；
78、进一步的，所述前引物序列如seq id no.3所示，所述后引物序列如seq id no.6所示；
79、进一步的，所述前引物序列如seq id no.4所示，所述后引物序列如seq id no.6所示；
80、进一步的，所述前引物序列如seq id no.5所示，所述后引物序列如seq id no.6所示。
81、进一步的，所述试剂盒还包括pcr反应体系；
82、进一步的，所述pcr反应体系包括pcr缓冲液、dntps、dna聚合酶、dmso、无菌去离子水、甜菜碱中的任意一种或多种；
83、进一步的，所述dna聚合酶包括kod fx neo酶；
84、进一步的，所述pcr缓冲液包括2x pcr buffer for kod fx neo；
85、进一步的，所述引物组合物中的所述前引物和所述后引物的体积比为1:1；
86、进一步的，所述试剂盒包括pcr缓冲液、dntps、引物组合物、dna聚合酶、dmso、无菌去离子水，所述pcr缓冲液、dntps、引物组合物、dna聚合酶、dmso、无菌去离子水的体积比为：20～27:8～10:1.5～2:0.4～1:0.6～1:9～19.5；
87、进一步的，所述试剂盒由以下组分组成：
88、
89、进一步的，所述甜菜碱为5m甜菜碱，用量为0-2μl。
90、进一步的，所述试剂盒还包括分别扩增smn1基因外显子1，外显子2，外显子3，外显子4，外显子5，外显子6，外显子7，外显子8的引物组。
91、本发明的目的之四涉及所述的引物组合物，所述的方法，所述的试剂盒在制备smn1微小突变检测、smn1外显子8纯合缺失检测、和/或sma辅助诊断检测产品中的应用。
92、本发明提供的利用引物的熔解温度差特异性扩增smn1的引物组合物、试剂盒、方法及其应用具有如下优点：
93、1、本发明通过引物熔解温度差异的设计提升了smn1扩增的特异性，减少了引物设计的负担。
94、2、本发明中包括扩增smn1的特异性引物和非特异性引物，所述特异性引物既能在高退火温度下扩增，也能在低退火温度下扩增；而非特异性引物只能在低退火温度下扩增，本发明通过高退火温度和低退火温度的循环进行扩增反应，在保证特异性扩增smn1的同时，平衡对dna两条链的扩增效率差别。
95、3、高退火温度和低退火温度的交替循环反应程序根据特异性引物和非特异性引物的熔解温度进行设计，提高了smn1扩增的特异性，得到的产物中smn1的比例相比smn2有显著差异，提高了smn1长片段扩增产物的产量，对非特异扩增产生强竞争抑制，产物能直接用于巢式pcr，不需要对产物进行额外的纯化，降低了检测成本、简化了检测流程。
96、4、使用本发明的方法、引物组合物或试剂盒能够便捷地区分smn1外显子8纯合缺失的sma患者与健康人基因组dna，并能够进一步检测smn1基因上的微小突变，简单便捷、准确性高，对sma辅助诊断有重要意义。
97、5、本发明的方法操作步骤简单、检测时间短、检测成本低，适合应用于大规模sma基因突变的携带者筛查。
1.一种用于特异性扩增smn1的引物组合物，包括前引物和后引物，所述前引物针对smn1基因5’utr区设计，后引物针对smn1基因外显子8处的特异性碱基设计；其特征在于，所述引物组合物通过所述前引物和后引物的熔解温度差异特异性扩增smn1。
2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述前引物与后引物的熔解温度差为10.5℃～13℃中的任意值，所述后引物的熔解温度高于所述前引物的熔解温度；
3.如权利要求1-2任意一项所述的引物组合物，其特征在于，所述前引物序列长度为16-21bp，熔解温度f-tm为60℃～63℃；所述后引物序列长度为25-31bp，熔解温度r-tm为70℃～76℃；
4.如权利要求1-3任意一项所述的引物组合物，其特征在于，所述前引物和/或所述后引物存在修饰；
5.一种利用引物熔解温度差特异性扩增smn1基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5任意一项所述的方法，其特征在于，
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤s3中的高退火温度和低退火温度交替循环的反应程序包括：
8.一种用于特异性扩增smn1的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应体系，所述pcr反应体系包括dna聚合酶、dmso、无菌去离子水、dntps、pcr缓冲液、甜菜碱中的任意一种或多种；所述引物组合物中的所述前引物和所述后引物的体积比为1:1。
10.权利要求1-4任意一项所述的引物组合物，权利要求5-7中任意一项所述的方法，或权利要求8-9任意一项所述的试剂盒在制备smn1微小突变检测、smn1外显子8纯合缺失、和/或sma辅助诊断检测产品中的应用。
