本发明涉及海洋生物基因工程领域，尤其是一种褐藻胶裂解酶aly6及重组表达载体、工程菌及方法。
背景技术：
1、褐藻胶是褐藻细胞壁的主要成分。不同藻种、不同生长时间以及不同部位的褐藻细胞壁中褐藻胶的含量各不相同，最高可达干重的40%。褐藻胶是由β-d-甘露糖醛酸（β-d-mannuronopyranosyl，m）单体和其c5差向异构体α-l-古罗糖醛酸（α-l-guluronopyranosyl，g）单体连接而成的线性多糖。褐藻胶作为一种来源于海洋的天然多糖，其组成、单体序列以及来源对其特性有着重要影响。其中，具有高含量g的褐藻胶表现出更强的胶凝性质，而具有高含量m的褐藻胶则更加粘稠。褐藻胶的凝胶特性被广泛应用于污水处理、土壤改良剂以及药物载体。海藻酸钠是褐藻胶的钠盐形式，通常作为褐藻胶的衍生物，海藻酸钠通常被认为是无毒和生物相容的，因此在医药和食品工业中有广泛应用。然而，由于褐藻胶的分子量较大，导致其溶解性和生物利用度较差，从而限制了其大规模应用。因此，科研人员一直致力于将大分子多糖转化为小分子多糖或寡糖，以提高其生物利用度并发挥多糖的最大功效。
2、酶降解法具有反应条件温和、生产步骤简单、生产效率高、低能耗等优点。基于以上原因，采用酶降解法制备褐藻寡糖受到了广泛的关注。褐藻胶裂解酶的来源极为广泛，主要来源于海洋藻类、细菌、真菌、软体动物和土壤微生物，甚至在个别病毒中也发现了褐藻胶裂解酶的存在。目前来源于海洋细菌的褐藻胶裂解酶是发现最多且来源最广的，如弧菌属、假单胞菌属、微泡菌属、类芽孢杆菌属等细菌。因此，筛选出高活性、底物适用性广和提高现有褐藻胶裂解酶的活性、稳定性成为了现在研究的特点。当前发现的褐藻胶裂解酶多为从不同生物体内分离得到的，存在活性不稳定、金属离子耐受性差等问题，因此开发具有优良特性的褐藻胶裂解酶，对于提高特定功能的褐藻寡糖的产量和品质具有重要的意义。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶aly6及重组表达载体、工程菌及方法，旨在解决现有技术中存在的问题。
2、本申请实施例提供了一种褐藻胶裂解酶aly6，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
3、扩增所述褐藻胶裂解酶aly6核苷酸序列所用的上游引物序列如seq id no:3所示，下游引物序列如seq id no:4所示。
4、一种重组表达载体，所述重组表达载体的遗传序列中插入了编码所述的褐藻胶裂解酶aly6氨基酸序列的核酸片段。
5、一种工程菌，所述工程菌内转化有所述的重组表达载体。
6、一种褐藻胶裂解酶aly6的应用方法，所述的褐藻胶裂解酶aly6在褐藻资源开发利用以及降解海藻酸钠来制备褐藻寡糖中的应用。
7、一种褐藻胶裂解酶aly6的制备方法，包括以下步骤：
8、s1、基于褐藻胶裂解酶aly6的核苷酸序列，设计并合成可特异性结合aly6核苷酸序列的引物，上游引物aly6f序列如seq id no:3所示，下游引物aly6r序列如seq id no:4所示；
9、s2、以mesonia sp.菌株基因组dna为模板进行pcr扩增；pcr产物经限制性内切酶hindiii和xhoi酶切后，用连接酶连接到用具同样酶切位点的载体上，后转入到大肠杆菌e.coli dh5α感受态中并涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基上进行筛选，获得含有褐藻胶裂解酶基因aly6f的重组表达载体；
10、s3、将重组表达载体从大肠杆菌e.coli dh5α中抽提后转化入e.coli bl21（de3）中，获得含有褐藻胶裂解酶aly6的重组菌株，将重组菌株接种于20ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基中稳定传代培养后，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导表达，离心收集菌体，裂解缓冲液重悬后，加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶，并超声破碎，收集离心上清液即得到粗酶液；
11、s4、将制备的粗酶液加入至预先平衡好的his标签，用10ml洗涤缓冲液洗涤3次，洗涤结束后用洗脱缓冲液洗脱4次，洗脱体积为5ml，分批收集洗脱液，对洗脱液进行sds-page电泳检测蛋白纯度,获得了纯化的褐藻胶裂解酶aly6。
12、裂解缓冲液为：20mm tris-hcl缓冲液，ph7.4；洗涤缓冲液为：20mm tris-hcl缓冲液，500mm nacl，2mm咪唑，ph7.4；洗脱缓冲液为20mm tris-hcl缓冲液，500mm nacl，50mm咪唑，ph7.4。
13、本发明的有益效果是：本发明的褐藻胶裂解酶对海藻酸钠具有底物偏好性，能很好地降解海藻酸钠，且在25℃～55℃范围内酶活力较高，具有较宽泛的作用温度，对多种金属离子具有较好的耐受性，在和不同底物偏好性的褐藻胶裂解酶联用开发褐藻资源，以及降解海藻酸钠制备特定功能褐藻寡糖方面具有优势。
1.一种褐藻胶裂解酶aly6，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
2.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶aly6，其特征在于，扩增褐藻胶裂解酶aly6核苷酸序列所用的上游引物序列如seq id no:3所示，下游引物序列如seq id no:4所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的遗传序列中插入了编码如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶aly6氨基酸序列的核酸片段。
4.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌内转化有如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶aly6的应用方法，其特征在于，所述的褐藻胶裂解酶aly6在褐藻资源开发利用中的应用。
6.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶aly6的应用方法，其特征在于，所述的褐藻胶裂解酶aly6在降解海藻酸钠来制备褐藻寡糖中的应用。
7.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶aly6的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的褐藻胶裂解酶aly6的制备方法，其特征在于，裂解缓冲液为：20mm tris-hcl缓冲液，ph7.4；洗涤缓冲液为：20mm tris-hcl缓冲液，500mm nacl，2mm咪唑，ph7.4；洗脱缓冲液为20mm tris-hcl缓冲液，500mm nacl，50mm咪唑，ph7.4。
