本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种复合益生菌囊泡、负载木犀草素的复合益生菌囊泡及其制备方法与应用。
背景技术：
1、溃疡性结肠炎(uc)是一种累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症，属于炎症性肠病(ibd)范畴,临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等。uc的病因及发病机制尚未明确，目前认为和遗传易感性、免疫调节紊乱、感染及环境等因素有关。ibd在亚洲的发病率逐年上升，寻找有效的治疗方法是当前亟待解决的问题。
2、有关uc的治疗，目前国内外多采用抗生素治疗手段，副作用大，且容易出现耐药性。益生菌在uc治疗中的应用为当下研究热点，但其直接给药可能有如下弊端：对免疫低下的患者造成免疫过强导致免疫紊乱；过度依赖益生菌导致肠道菌群失调；一些患者有过敏反应等。另有研究表明食物中天然多酚可以有效改善uc症状，如木犀草素。但木犀草素的水溶性和脂溶性差，生物利用度低。
技术实现思路
1、基于上述技术背景，本发明的主要目的在于提供一种复合益生菌囊泡、负载木犀草素的复合益生菌囊泡及其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。
2、益生菌外囊泡做为一种纳米颗粒，其特殊的脂质双分子层结构可以做为药物递送载体，并能提高生物活性物质的稳定性。不同来源的细胞外囊泡，由于其特异性蛋白含量不同而具有不同的功能。复合益生菌进行混合发酵，一方面可以提高发酵产率，另一方面，复合发酵产生的外泌体含有更多的特异性蛋白，可能具有更好的治疗效果。
3、因此本发明主要通过复合益生菌囊泡负载木犀草素，一方面提高木犀草素的生物利用度，另一方面通过负载木犀草素，提高复合益生菌囊泡的抗氧化性，进而提高负载木犀草素的复合益生菌囊泡治疗uc的效果。
4、为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
5、本发明第一方面在于提供一种复合益生菌囊泡的制备方法，所述制备方法包括：
6、步骤1、将混合益生菌进行活化，然后将活化后的混合益生菌加入培养基中进行发酵培养，得到发酵产物；
7、步骤2、将发酵产物离心，分离得到上清液后进行第二次离心，将第二次离心后分离得到的上清液进行过滤，将过滤产物进行第三次离心，所得沉淀即为复合益生菌囊泡。
8、复合益生菌囊泡是益生菌分泌的一种细胞外囊泡。
9、优选地，步骤1中，所述混合益生菌包括长双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌。
10、更优选地，所述长双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌和丁酸梭菌的质量比为1:1:1。
11、优选地，步骤1中，
12、所述活化条件为：将混合益生菌于35～38℃、ph＝6～7的mrs培养基中厌氧发酵20～30h。
13、将活化后的混合益生菌加入mrs培养基内，混合益生菌的添加量为mrs培养基的2.4～3.6wt％，然后向mrs培养基中加入0.5～2mg/ml的l-半胱胺酸盐溶液，随后于36～38℃复合发酵培养20～30h，得到发酵产物。
14、优选地，步骤2中，
15、将发酵产物于2000～4000×g进行离心，将分离得到的上清液于10000～12000×g进行第二次离心，将第二次离心后分离得到的上清液通过0.2～0.3μm的过滤膜进行过滤，将过滤产物于100000～200000×g进行第三次离心，所得沉淀即为复合益生菌囊泡。
16、本发明第二方面在于提供一种根据本发明第一方面所述的复合益生菌囊泡的制备方法制得的复合益生菌囊泡，所述复合益生菌囊泡为球形纳米颗粒，直径为100-200nm。
17、本发明第三方面在于提供一种负载木犀草素的复合益生菌囊泡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
18、将木犀草素加入由本发明第一方面所述制备方法制得的复合益生菌囊泡中，进行超声处理，随后经孵育、超滤离心，即得负载木犀草素的复合益生菌囊泡。
19、优选地，向木犀草素中加入无水乙醇，得到1mg/ml的木犀草素溶液，然后稀释至木犀草素的含量为0.05～0.25mg/ml；
20、将复合益生菌囊泡的蛋白质含量稀释至0.15～0.25mg/ml。
21、所述超声处理的条件为：在15～25％的超声频率下于冰上超声，3s开，3s关，重复20～40个循环；
22、超声结束后，于37℃水浴孵育0.5～2h，然后经20～40kd的滤膜过滤处理，于2000×g～4000×g离心5～20min。
23、本发明第四方面在于提供一种根据本发明第三方面所述的负载木犀草素的复合益生菌囊泡的制备方法制得的负载木犀草素的复合益生菌囊泡。
24、本发明第五方面在于提供一种本发明二方面所述复合益生菌囊泡或本发明第四方面所述负载木犀草素的复合益生菌囊泡在生物医药材料领域中的应用。
25、本发明所具有的有益效果：
26、(1)本发明所述制备方法制得的复合益生菌囊泡，相比复合益生菌，储存稳定性高；相比单一益生菌囊泡，蛋白种类更为丰富，抗氧化能力更强，且大幅提高防治溃疡性结肠炎的效果，避免单一囊泡给药治疗效果不明显的缺陷。
27、(2)本发明制得的负载木犀草素的复合益生菌囊泡提高了木犀草素的稳定性，减少胃肠液造成生物活性物质结构的破坏。
28、(3)本发明制得的负载木犀草素的复合益生菌囊泡能够有效防治溃疡性结肠炎，具有治疗效果好、不含激素、不含防腐剂、服用安全无不良反应的优点，同时无免疫风险，适合各类人群使用。
29、(4)本发明制得的负载木犀草素的复合益生菌囊泡在防治dss诱导的小鼠结肠炎模型的实验结果显示：其能有效减轻小鼠的结肠炎症状，包括体重减轻，结肠长度减少和dai指数，同时，载药后制剂的抗氧化应激能力更强，有效恢复了肠道屏障作用，从而提高抵御病原菌入侵的能力。
1.一种复合益生菌囊泡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述混合益生菌包括长双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，
6.一种根据权利要求1至5之一所述制备方法制得的复合益生菌囊泡，所述复合益生菌囊泡为球形纳米颗粒，直径为100-200nm。
7.一种负载木犀草素的复合益生菌囊泡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，
9.一种权利要求7或8所述的制备方法制得的负载木犀草素的复合益生菌囊泡。
10.一种权利要求6所述的复合益生菌囊泡或权利要求9所述的负载木犀草素的复合益生菌囊泡在生物医药材料领域中的应用。
