本发明涉及家畜病毒检测，具体为一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、猪流感病毒猪流感(swine influence，si)是由a型猪流感病毒(siv)引起猪的一种急性、热性、高度接触性和群发性呼吸道疾病，临床上以高热、厌食、咳嗽、呼吸困难和怀孕母猪繁殖障碍为典型表现。si广泛流行于全球各主要养猪国家和地区。目前我国规模化养猪场的h1n1和h3n2亚型siv流行和危害比较严重且难以根除，给我国和世界上的养猪业造成严重经济损失。
2、si的传统诊断方法主要是病毒分离培养，将采集的猪鼻腔拭子和疑似病料接种spf鸡胚或mdck细胞，然后对培养物进行血清学诊断，此种方法存在操作繁琐、诊断时间长及由于采集样品污染造成的结果不确定等问题,给猪流感病毒的准确分型带来了困难。pcr已经成为目前生物科学，诊断学和法医学中使用的最具有价值的技术之一。
3、随着国内外研究的不断发展，建立了多重taqman荧光定量rt-pcr技术，其中每个探针都用独特的荧光染料标记，每种测定会产生不同的观察颜色。不同的荧光染料在同一管中反应可以特异性识别不同的荧光信号和每种靶标的量taqman探针法被广泛用于病毒流行病学监测和发病机制研究。
4、为了操作简便、节省时间、提高鉴定的准确性，本研究初步建立了siv检测方法用于h1n1、h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒。该试剂盒可快速、精准的确诊猪流感病毒h1n1、h3n2的感染，为养猪场提前做好生物安全防范、药物治疗和疫苗防控提供技术支撑。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中所存在的上述缺陷，本发明提供了一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒及其应用。
2、一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，所述双重taqman荧光定量检测试剂盒包括正向引物siv-h1-f、siv-h3-f，反向引物siv-h1-r、siv-h3-r，荧光探针siv-h1-p、siv-h3-p，以及荧光定量扩增试剂；
3、所述正向引物siv-h1-f的核苷酸序列如：seq id no:1所示；
4、所述反向引物siv-h1-r的核苷酸序列如：seq id no:2所示；
5、所述正向引物siv-h3-f的核苷酸序列如：seq id no:3所示；
6、所述反向引物siv-h3-r的核苷酸序列如：seq id no:4所示；
7、所述荧光探针siv-h1-p的核苷酸序列如：seq id no:5所示；
8、所述荧光探针siv-h3-p的核苷酸序列如：seq id no:6所示；
9、所述双重taqman荧光定量检测试剂盒中，检测引物、荧光探针和荧光定量扩增试剂以全预混的形式存在；
10、引物的浓度各自独立地为0.6μm～1.0μm，荧光探针的浓度各自独立地为0.2μm～0.6μm。
11、进一步的，所述荧光定量扩增试剂包括以下浓度的组分：mgcl22.3～2.8mm、dntp0.1～0.4mm、逆转录酶55～65ng/μl、atp 2～4mm、肌酸激酶75～85ng/μl、dna聚合酶0.1～0.2u/μl。
12、进一步的，所述荧光探针siv-h1-p 5’末端携带报告荧光基团fam，所述荧光探针siv-h1-p的3’末端携带淬灭荧光基团mgb。
13、进一步的，所述荧光探针siv-h3-p 5’末端携带报告荧光基团ned，所述荧光探针siv-h3-p的3’末端携带淬灭荧光基团mgb。
14、进一步的，所述双重taqman荧光定量检测试剂盒中，所述正向引物siv-h1-f、反向引物siv-h1-r的浓度为0.8μm，荧光探针siv-h1-p的浓度为0.4μm。
15、进一步的，所述双重taqman荧光定量检测试剂盒中，所述正向引物siv-h3-f、反向引物siv-h3-r的浓度为0.8μm，荧光探针siv-h3-p的浓度为0.4μm。
16、进一步的，还包括阳性对照品和阴性对照品；
17、所述阳性对照品为混合阳性质粒，包括含猪流感病毒h1n1特异基因片段的质粒和含有猪流感病毒h3n2特异基因片段的质粒；
18、所述阴性对照品为双蒸馏水。
19、进一步的，所述的用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒在猪流感临床诊断的应用。
20、本发明的有益技术效果是：本发明提供了一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，该试剂盒可快速、精准的确诊siv h1n1、h3n2的感染，操作更节约成本可一管多检，为养猪场提前做好生物安全防范、药物治疗和疫苗防控提供技术支撑。
1.一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述双重taqman荧光定量检测试剂盒包括正向引物siv-h1-f、siv-h3-f，反向引物siv-h1-r、siv-h3-r，荧光探针siv-h1-p、siv-h3-p，以及荧光定量扩增试剂；
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量扩增试剂包括以下浓度的组分：mgcl2 2.3～2.8mm、dntp 0.1～0.4mm、逆转录酶55～65ng/μl、atp 2～4mm、肌酸激酶75～85ng/μl、dna聚合酶0.1～0.2u/μl。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针siv-h1-p 5’末端携带报告荧光基团fam，所述荧光探针siv-h1-p的3’末端携带淬灭荧光基团mgb。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针siv-h3-p 5’末端携带报告荧光基团ned，所述荧光探针siv-h3-p的3’末端携带淬灭荧光基团mgb。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述双重taqman荧光定量检测试剂盒中，所述正向引物siv-h1-f、反向引物siv-h1-r的浓度为0.8μm，荧光探针siv-h1-p的浓度为0.4μm。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述双重taqman荧光定量检测试剂盒中，所述正向引物siv-h3-f、反向引物siv-h3-r的浓度为0.8μm，荧光探针siv-h3-p的浓度为0.4μm。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品；
8.根据权利要求1-7任一项所述的用于检测猪流感病毒h1n1和h3n2双重taqman荧光定量检测试剂盒在猪流感临床诊断的应用。
