本发明涉及生物医药领域,特别涉及一种在表面展示抗原，还能持续表达抗原的双功能腺病毒载体及其用途。
背景技术：
1、传染病是全球公共卫生领域面临的重大挑战之一，而疫苗则是预防和控制传染病的最有效工具[1]。然而，对于一些具有高度变异性的病原体，如hiv-1和sars-cov-2，现有的疫苗未能提供广谱有效的保护。主要原因在于目前的疫苗设计难以诱导产生针对这些病毒众多突变株的广谱中和抗体(bnabs)[2]。
2、研究表明，生发中心(gc)应答是b细胞免疫应答的核心，是诱导bnabs产生的关键所在[3]。在gc中，被激活的b细胞首先在暗区(dark zone，dz)进行增殖，并获得体细胞超突变(somatic hypermutation，shm)。增殖后的b细胞进入亮区(light zone，lz)进行筛选，通过与抗原表位竞争性结合，能够有效结合抗原表位的b细胞将分化成浆细胞(plasmabcell)或记忆b细胞(memory b cell)，或再次进入dz进行新一轮的增殖[4]。为了获得识别抗原保守表位的bnabs，b细胞需要在gc中经过多轮的循环筛选，获得大量的shm。因此，有效持久的gc是bnabs产生的基础[5]。
3、新兴的纳米疫苗在预防和控制传染病方面展现出诸多优势[6,7]。一方面，由于其独特的物理形式，纳米疫苗能够更有效地将抗原被动富集至淋巴结，并被抗原提呈细胞(antigen presenting cells，apcs)识别。另一方面，纳米疫苗通过多拷贝展示抗原，能够与血清中的凝集素多拷贝结合，从而主动更有效地富集到淋巴结。同时，多拷贝展示的抗原能够多拷贝激活b细胞受体(b cell receptor，bcr)，从而直接激活b细胞并更有效地提呈抗原。这些优势使得纳米疫苗能够诱导更加高效的gc应答[8]。
4、目前，纳米疫苗大致可分为两类。一类是自组装蛋白纳米疫苗，如铁蛋白、热休克蛋白或丙酮酸脱氢酶复合物的e2亚基融合抗原形成的自组装纳米疫苗[9]；另一类是合成纳米颗粒结合抗原形成的纳米疫苗，如脂质、无机物和聚合物等作为纳米载体结合抗原形成的纳米疫苗[10]。这两类纳米疫苗都显示出更强的免疫原性，目前已被证明可有效预防多种疾病，包括艾滋病、流感和covid-19。然而，这些基于纳米形式的疫苗，其抗原通常会被快速捕获并迅速消耗，难以提供持续的刺激以维持gc的应答。因此，设计出能同时快速诱导gc应答并为免疫系统提供持续刺激的新型纳米载体显得尤为重要[11,12]。
5、本发明旨在设计构建一种基于腺病毒载体的新型纳米载体，希望通过同时利用病毒载体的递送和表达功能，提升gc应答水平，进而促进bnabs的产生。腺病毒载体作为一种70～90nm大小的病毒颗粒，因其纳米级别的物理形式，可以通过在表面展示抗原，在免疫后快速富集到淋巴结，实现对抗原的高效递送[13]。同时，腺病毒载体能够结合多拷贝展示和自佐剂作用，从而快速启动gc应答。腺病毒载体疫苗的另一个主要优势在于其能够持续表达抗原，从而为免疫系统提供长期的刺激。这种持续的抗原表达有助于维持gc应答，促进广谱中和抗体(bnabs)的产生。
6、本发明的目的就是利用腺病毒这一理想的纳米载体，通过腺病毒ix号结构蛋白上融合表达zipper连接肽，一方面将免疫原定向连接至腺病毒载体表面，通过有效富集淋巴结以及多价呈递抗原直接激活b细胞的能力，快速诱导强效的gc反应(主要包括gc b细胞、tfh细胞和记忆b细胞)。同时通过基因组e1区插入的抗原序列持续表达抗原，为gc持续提供筛选信号，从而诱导持续的gc应答，为bnabs提供持续的筛选，为机体提供广谱的保护。
7、综合以上所述，我们的设计是一种表达和表面展示抗原的双功能腺病毒载体。希望通过同时利用病毒载体的递送和表达功能，提升gc应答水平，进而促进bnabs的产生。对双功能腺病毒载体的机制研究，发现其除了能够快速诱导持久的gc应答之外，相比于传统的腺病毒还能够有效减少针对腺病毒本身的免疫应答，产生更多的针对抗原的特异性免疫应答，产生更高的抗体水平，发挥出更好的保护效果。
技术实现思路
1、本发明提供了一种双功能腺病毒载体，通过腺病毒ix号结构蛋白上融合表达结合肽和抗原的结合肽配对实现特异性结合，同时通过基因组e1区插入抗原序列持续表达抗原。该双功能腺病毒载体不仅在表面展示抗原，还能持续表达抗原，从而实现高效的抗原递送和表达。
2、本发明提供的腺病毒载体azk37，通过连接肽在病毒载体表面展示抗原，形成纳米疫苗，能够快速诱导有效的gc应答。进一步优化的双功能腺病毒载体azk37/pcm在病毒载体表面展示抗原的基础上，同时实现抗原的高效递送和持续表达，为生发中心(gc)应答提供了持续的刺激，从而诱导更有效和持久的gc应答，诱导更强的中和应答。
3、本发明的双功能腺病毒载体azk37/pcm显著提升了针对抗原的特异性免疫应答，同时降低了针对腺病毒本身的特异性免疫应答，展示了其逃逸预存免疫的潜力。
4、本发明提供了一种双功能腺病毒载体可以根据不同疾病的需求，选择编码不同类型的抗原序列，并通过结合肽在表面展示抗原，从而显著提升针对抗原的特异性免疫应答，并在一定程度上逃逸预存免疫，是一种具有广泛应用潜力的新型腺病毒载体。
1.一种双功能腺病毒载体，其特征在于：经基因工程改造，能够在表面展示抗原并持续表达抗原，从而有效提升抗原或所载药物诱导免疫应答的能力。
2.如权利要求1所述的双功能腺病毒载体，其特征在于：所述的腺病毒载体通过在ix号结构蛋白上融合表达结合肽，使其能够在表面展示抗原或药物。
3.如权利要求2所述的双功能腺病毒载体，其特征在于：所述的腺病毒为基因组e1区插入抗原序列的腺病毒，能够持续表达抗原或药物。
4.如权利要求1所述的双功能腺病毒载体，其特征在于：用于治疗的疾病类型包括但不限于病毒感染性疾病和肿瘤。
5.如权利要求1所述的双功能腺病毒载体，其特征在于：其给药方式包括皮下注射、肌肉注射等途径。
6.权利要求2-5任一项所述的双功能腺病毒载体用于制备疫苗和肿瘤治疗药物载体的用途。
