本发明属于功能性有效成分提取，涉及姬松茸多糖，具体地说是一种超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法。
背景技术：
1、姬松茸（ agaricus blazei murill）原产于巴西，又被称为巴西蘑菇和小松菇，是一种珍稀药食兼用真菌，生活在高温、潮湿和通风的环境中，原产于巴西、秘鲁，在真菌分类上属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属。姬松茸的子实体粗壮，菌盖直径5-11cm，表面有淡褐色至栗色的纤维状鳞片；菌盖中心的菌肉厚达11 mm，菌肉白色，菌褶离生，密集；菌柄圆柱状，菌环大，上位，膜质，初白色，后微褐色；孢子阔椭圆形至卵形，没有芽孔。
2、姬松茸新鲜子实体含水分85%～87%，可食部分为每100 g干品中含粗蛋白40～45g、可溶性糖类38～45 g、粗纤维6～8 g、脂肪3～4 g、灰分5～7 g；其蛋白质组成中包括18种氨基酸，人体的8种必需氨基酸齐全，还含有多种维生素和麦角甾醇。姬松茸子实体含有丰富的多糖、糖蛋白复合体、甾醇类等活性物质，除了各种珍贵的维生素和矿物质外，姬松茸的多聚糖含量是所有已知保健真菌中最高的，主要是β-葡聚糖d。
3、姬松茸多糖是姬松茸的最有效成分之一，姬松茸多糖存在于姬松茸的细胞壁内壁，具有螺旋状的三维立体结构，是一种β型的葡聚糖，大分子化合物，不溶于高浓度的酒精，微溶于低浓度的酒精及冷水，在热水中能全部溶解。姬松茸多糖进入人体后不会被消化系统消化、分解，而是直接作用于细胞膜上的受体，使其发生药理作用，其药效显著并多样，而且许多效果是其他真菌多糖所不具备的。
4、研究表明姬松茸多糖具有抗氧化、调节机体免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗抑郁、降血脂、降胆固醇、改善动脉硬化的功效，而且，在无法进行手术也无法使用放射或化学疗法的情况下，它也同样有效。姬松茸及其提取物可以迅速有效的降低化学疗法等传统治疗方法所带来的痛苦和危险性。
5、已经报道的姬松茸多糖的提取方法包括：热水浸提法、溶剂提取法、复合酶提取法、高速剪切提取、超声波循环提取等。常规提取方法易破坏有效成分的生物活性，存在提取时间长，提取率相对较低、提取纯度低的缺点。
6、超高压提取技术是一项新发展起来的天然产物活性成分提取技术，其原理是在常温下用100-1000 mpa的流体静压力作用于料液上，保压一段时间后迅速卸压，以便突然增大细胞内外的渗透压差，使细胞中的各种膜结构遭到破坏，以利于活性成分的提取。同多糖的其它提取方法相比，超高压提取方法具有提取效率高、提取时间短、操作步骤不繁琐、能源消耗低以及提取物较纯净等优点。此外，超高压提取法由于整个操作过程是在常温下进行的，多糖的生物活性不会因热而发生改变(食药用真菌中的生物活性物质及其应用研究，王广慧编著，第1版，第20-24页，黑龙江大学出版社，公开日:2015年06月30日)。
7、申请号 201310676570.8公开了一种超高压提取松茸多糖的工艺。将称取粉碎后的松茸，加入去离子水，水的用量为松茸质量的30倍，即v/w的值为30，加热至50℃，压力300mpa,保压5分钟；多糖的得率最高为19.2％。
8、申请号 202011201766.8超高压提取姬松茸多糖的方法及其应用，步骤s1中过筛目数为20～80目，粉末a与水的质量比为1：10～1：70，超高压处理的条件为温度23～27 ℃，压力100～400 mpa，保压时间为5～30 min。多糖最高得率18.33%。
9、显然单纯的超高压提取已经无法提高继续多糖得率，需要有一种研发一种综合的多糖提取方法，以提高经济效益。
技术实现思路
1、本发明的目的，是要解决单一的超高压提取姬松茸多糖，得率无法更高的技术问题。提供一种超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，以提高姬松茸多糖的提取效率。
2、本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
3、一种超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，包括以下步骤：
4、s1、将姬松茸子实体65 ℃烘至恒重，粉碎40目过筛得到粉末a，加酶，加入纯水将其混合后，进行超声波处理，再进行超高压处理，得到混合液b；
5、s2、将混合液b减压，离心，取上清夜进行旋转蒸发浓缩处理，得到浓缩液c；
6、s3、浓缩液c中加入95%乙醇，进行醇沉处理后，离心，弃掉上清液，得到沉淀d；
7、s4、将沉淀干燥，即得姬松茸多糖。
8、作为限定：步骤s1中过筛目数为40目，酶为纤维素酶，添加量为粉末a质量的4%，粉末a与水的质量比为1：35，超声波处理功率为500 w，温度45~55 ℃，时间45~55 min，超高压处理条件为温度25 ℃，压力300 mpa，保压时间为20~30 min。
9、作为限定，步骤s2中离心转数4500 rpm，时间为15 min，温度为4 ℃。
10、作为限定：步骤s2中旋转蒸发器的浓缩温度为65 ℃，转数为65 r/min，浓缩至粘稠，得到浓缩液c。
11、作为限定：步骤s3中浓缩液c与95%乙醇的体积比为1：4，醇沉温度为4 ℃，醇沉时间为12 h。
12、作为限定，步骤s3中离心转数4500 r/min，时间为15 min，温度为4 ℃。
13、作为限定：步骤s4中干燥温度为65 ℃，干燥时间为12 h，即得姬松茸多糖e。
14、多糖得率计算公式如下：y(％)＝（e/a）×100％；式中：y为多糖得率(％)，e为干燥后姬松茸多糖重量，a为称取样品质量(g)。
15、上述步骤2的料液比为1：35，纤维素酶添加量为4%，超声波功率为500w，超声时间为50 min，超声温度为50 ℃，超高压功率为300 mpa，保压时间为25 min。
16、以a超声温度、b超声时间、c超高压保压时间为自变量，姬松茸多糖得率为响应值，建立17个响应面试验方案。
17、多糖得率回归方程拟合及方差分析：对各因素回归拟合后，以a、b、c为自变量对多糖得率y进行数据拟合建立如下多元二次回归方程：
18、y=25.15+0.43a+0.86b-0.10c+0.89ab+0.64bc-2.84a2-2.33b2-4.02c2。
19、与现有技术相比，本发明提供了一种响应面法优化超声酶解协同超高压的提取方法，以水作为提取剂，具有提取时间短、有效成分活性高。超声酶解协同超高压提取法因提取高效、操作简单、活性损失小、无有机溶剂残留等优点。
20、本发明采用超声波酶解协同超高压的方法完善姬松茸多糖产品生产工艺，以姬松茸多糖得率为指标，通过考察响应面优化试验来确定姬松茸多糖提取的最佳工艺参数。对于提高姬松茸多糖产品附加值，满足市场需求，具有重大的经济效益和社会效益。
21、本发明由于采用了上述方案，与现有技术相比，所取得的有益效果是：
22、（1）本发明提供的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，直接使用水作为提取液，加入纤维素酶破裂细胞结构，姬松茸和纤维素酶溶于水，先进行超声波处理，促使生物细胞壁的破碎，释放多糖，再进行超高压处理，高压破坏下细胞结构多糖解离，方法简便，成本低；水与姬松茸子实体粉末的比例合适，使细胞内部与外部溶剂间产生较大的浓度差的同时，也不会因为溶剂过多而导致姬松茸多糖成分的损失，能够使姬松茸多糖充分释放出来；
23、（2）使用纤维素酶可以在进行超声波提取前对姬松茸进行预先处理，其机制是在纤维素酶的作用下溶解细胞壁，相比其他破壁方法，使用酶法破壁比较彻底，破壁效果明显好于化学法。一方面通过降解植物细胞壁使有效成分更易提取，从而达到提高提取收率或降低溶剂消耗量的目的；另一方面可以针对植物药中的大多数杂质（淀粉、果胶、蛋白质等）选择性降解，以利于之后超声波的提取。
24、（3）本发明提供的超高压技术，超高压提取过程处于密闭的环境中，没有溶剂挥发，不会对环境造成污染，符合绿色环保要求，而且超高压提取技术属于非热技术，具有升压速度快、萃取温度适宜、萃取时间短、萃取效率高等优点，在提取过程中对姬松茸多糖结构没有影响，较大程度保留了姬松茸多糖的活性，此外，超高压力使得溶剂进入植物细胞内部，泄压后溶剂可带着有效成分溢出，提高姬松茸多糖提取的效率，超高压保压值为300mpa，保压时间为20～30 min，在此压力范围和时间范围内，姬松茸多糖释放效果明显。
25、（4）本发明提供的超高压提取姬松茸多糖的方法，醇沉温度为4 ℃～8 ℃，溶液不结冰，杂质更易停留在晶格中不易沉淀。
26、（5）本发明提供的一种超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，保护了多糖的结构和活性，缩短了提取时间，提高了姬松茸多糖的提取率。
1.一种超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：步骤s1中过筛目数为40目，酶为纤维素酶，添加量为粉末a质量的4%，粉末a与水的质量比为1：35，超声波处理功率为500 w，温度45~55 ℃，时间45~55 min，超高压处理条件为温度25℃，压力300 mpa，保压时间为20~30 min。
3.根据权利要求1所述的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：步骤s2中离心转数4500 rpm，时间为15 min，温度为4 ℃。
4.根据权利要求1所述的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：步骤s2中旋转蒸发器的浓缩温度为65 ℃，转数为65 r/min，浓缩至粘稠，得到浓缩液c。
5.根据权利要求1所述的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：步骤s3中浓缩液c与95%乙醇的体积比为1：4，醇沉温度为4 ℃，醇沉时间为12 h。
6.根据权利要求1所述的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：步骤s3中离心转数4500 r/min，时间为15 min，温度为4 ℃。
7.根据权利要求1所述的超声波酶解协同超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于：步骤s4中干燥温度为65 ℃，干燥时间为12 h，即得姬松茸多糖e。
