本发明属于生物工程领域，具体涉及用于生产一种半胱氨酸水解酶(免疫球蛋白g降解酶)的工程菌株和生产工艺。
背景技术：
1、来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白g降解酶(immunoglobulin g-degrading enzyme of spyogenes，ides)是一种典型的半胱氨酸水解酶。ides蛋白酶最初从血清型为m1的a组链球菌菌株中被分离得到。ides蛋白酶具有极高的底物特异性，仅识别igg铰链区的特定位点(ch1结构域和ch2结构域之间)进行切割，以产生f(ab’)2和fc片段。ides蛋白酶能够切割多种动物来源的igg，其底物特异性、切割位点的专一性使其在抗体药物或fc融合蛋白药物的结构解析中得到广泛应用。
2、近年来，ides的酶切特性也得到了开发和利用。例如，基于ides能够切割免疫球蛋白的能力，将ides作为一种免疫抑制剂应用于人类免疫疾病及器官移植等领域。随着用途的扩展，对于ides蛋白酶的高效表达及制备工艺提出了挑战。
3、ides蛋白酶的制备最初利用了其原始生产菌酿脓链球菌，但表达量受到限制。而后，多数学者选择在基因工程常用宿主大肠杆菌表达系统中表达ides蛋白酶。许静等人在“半胱氨酸蛋白酶ides的原核表达、纯化及活性鉴定”(中国生物工程杂志，2014，34(10):8-14)中，描述了利用双标签(gst及his6)表达系统在大肠杆菌中高效表达可溶性gst-ides-his6的方法，并进行了纯化制备与分析鉴定。在许静的方法中，每1升菌液可获得纯度大于90％的ides蛋白酶25mg，此法的表达水平仍然不高，难以大规模应用。除此之外，分子中所引入的标签使药物的人体应用受到限制，大大增加了免疫原性风险，在生物制药领域的应用通常会受到限制。
4、ides蛋白酶在不同类型的大肠杆菌菌株中表达量差异较大，且由于该分子特性，导致目标表达定位不稳定。而且在不同菌株中，目标蛋白表达量随着菌种代次增加而具有差异性，甚至出现质粒随代次增加而丢失的情况。因此，为了进行ides蛋白酶的大规模生产和应用，首要目标是构建稳定表达目标蛋白酶的菌株，并再此基础上尽可能提高目标表达产量，以满足工艺放大需求。
5、另外一个问题是如何解决ides蛋白酶作为外源蛋白在原核细胞中表达时易形成包涵体。大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比，具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。通过大肠杆菌表达重组蛋白既高效又经济。然而，大肠杆菌是一种原核生物，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，不易形成二硫键，会出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。如果大量形成了包涵体，则需要在下游进行包涵体变复性的步骤，使得整个制备过程变得繁琐，增加了成本和不确定性。
6、现有的文献报道中描述了一些ides制备方法，这些方法通常利用使表达的ides带有特定标签并利用标签进行亲和纯化。这些方法一般仅关注目标ides的纯度和活性，较少进行关于宿主杂质残留、与安全性相关的内毒素控制、无菌性等的研究。
7、在蛋白生物药的商业化过程中，对于直接注射入人体的蛋白药物而言，通常会选择利用其天然结构且不引入标签，从而降低潜在的免疫原性及对活性的影响。因此，需要开发一种不基于标签的目的蛋白下游纯化方法，并获得理化特性和安全性均合格的产品。
8、现在亟需一种能够降低ides蛋白酶的包涵体比例的生产菌株配套的发酵、纯化工艺，以提高ides蛋白酶在大肠杆菌中的可溶性表达，并适用规模化生产。
技术实现思路
1、本发明的发明人进行了大量探索，以期获得改进的表达免疫球蛋白g降解酶的生产菌株，以及用于生产所述酶的发酵、纯化工艺。
2、发明人对用于表达的ides蛋白酶的编码核苷酸序列进行了密码子优化，并通过大量筛选和多种评价手段(如质粒保有率测试、表达量测试、传代稳定性实验)，确定了用于表达ides蛋白酶的载体和大肠杆菌菌株的优化组合。所述组合能在大肠杆菌细胞间质中高效、稳定地表达ides蛋白酶，显著优于其他组合。
3、发明人还优化了对应的发酵、纯化工艺。采用所述工艺后，上述菌株表达的ides蛋白酶几乎全部为可溶性蛋白形式(不形成包涵体)，且表达量显著提高。另外，本发明的工艺能够实现规模化放大，适用于产业上的大规模生产。
4、相应地，本发明包括以下内容。
5、第一方面，本发明提供编码酿脓链球菌的免疫球蛋白g降解酶(ides蛋白酶)的核苷酸序列，所述ides蛋白酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述核苷酸序列包含如seqid no：2-12中任一种所示的核苷酸序列，或由其组成。所述核苷酸序列是经过密码子优化的ides蛋白酶编码序列。
6、第二方面，本发明提供一种重组表达载体，其包含第一方面的核苷酸序列。
7、第三方面，本发明提供了一种表达ides的工程菌株，所述工程菌株为包含重组表达载体的大肠杆菌，所述重组表达载体为包含第一方面的核苷酸序列的表达载体，
8、其中所述大肠杆菌为选自下组的大肠杆菌菌株：hms174(de3)、bl21(de3)和bl21sta r(de3)；且
9、所述表达载体为pet-9a或pet200/d-topo。
10、在优选的实施方案中，所述菌株和表达载体的组合选自下列组合之一：
11、(1)菌株为hms174(de3)且表达载体为pet-9a(pet-9a-hms174(de3)-ides)；
12、(2)菌株为bl21(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-bl21(de3)-ides)，和
13、(3)菌株为bl21 star(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-bl21 star(de3)-ides)。
14、在更优选的实施方案中，所述菌株为bl21(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-topo-bl21(de3)-ides)。
15、第四方面，本发明提供了一种ides蛋白酶的生产方法，所述方法包括：
16、(a)将第三方面的工程菌株接种到培养瓶中进行种子培养，至od600达到1.0-2.1，以获得种子培养物；
17、(b)将步骤(a)获得的种子培养物接种到发酵罐中进行发酵培养；
18、(c)在od600达到40-50时加入诱导剂，以诱导ides蛋白酶的表达；
19、(d)收获菌体以获得含有ides蛋白酶的样品。
20、优选地，在步骤(b)中：发酵温度为30℃，进行诱导前将温度降为29℃，加入诱导剂后将诱导温度设为25℃。
21、第五方面，本发明提供了一种ides蛋白酶的生产方法，包括：
22、(a)将经过培养的第四方面的工程菌株通过化学或物理方法破碎，以获得包含ides蛋白酶的裂解液；
23、(b)对步骤(a)中的裂解液进行过滤，以获得包含ides蛋白酶的滤液；
24、(c)对步骤(b)中获得的滤液进行层析处理，以获得纯化的包含ides蛋白酶的溶液。
25、在优选的实施方案中，所述步骤(c)中的层析处理包含不同原理的多个层析处理，例如3个或4个。
26、在具体的实施方案中，所述步骤(c)中层析处理包含不同原理的3个层析步骤，依次为强阴离子层析、陶瓷羟磷灰石(cht)层析、疏水层析。
27、本发明的ides蛋白酶生产菌株和生产工艺至少具有如下优势。
28、-本发明构建的表达ides蛋白酶的工程菌株能在大肠杆菌细胞间质中高效稳定表达ides蛋白酶，质粒保有率≥90％且传代表达稳定。
29、-本发明的发酵工艺能够实现使目的蛋白ides蛋白酶几乎全部可溶表达，有效地避免在大肠杆菌中以包涵体形式表达。通过本发明的工艺制备的ides蛋白酶纯度高，不含标签，具有较低的杂质水平，并且能够有效控制内毒素水平。
30、-本发明的纯化步骤不涉及亲和标签的使用，而是通过多个不同的层析步骤进行纯化。不会涉及标签脱落而有免疫原性的问题，如此获得的ides酶会因不含标签而更加便于应用。
31、-本发明的工艺能够通过有效释放胞内物质、从宿主蛋白中分离纯化目标蛋白，有效控制宿主残留物，包括宿主蛋白质和dna。
1.一种编码ides蛋白酶的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:8、seqid no:6、seq id no:11、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:7、seq idno:9、seq id no:10或seq id no:12中任一项所示，并且所述核苷酸序列编码如seq idno:1所示的ides蛋白酶。
2.一种重组表达载体，其包含根据权利要求1所述的核酸分子。
3.一种用于表达ides蛋白酶的工程菌株，其为包含重组表达载体的大肠杆菌菌株，所述重组表达载体通过向表达载体中引入ides蛋白酶的编码核苷酸序列获得，所述编码核苷酸序列为如seq id no:8、seq id no:6、seq id ni:11、seq id no:3、seq id no:4、seq idno:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:10或seq id no:12中任一所示的核苷酸序列，其中：
4.根据权利要求3所述的工程菌株，其表达的ides蛋白酶不含标签。
5.根据权利要求3所述的工程菌株，其表达的ides蛋白酶不含纯化用标签。
6.一种生产ides蛋白酶的方法，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，
8.根据权利要求7所述的方法，在步骤(b)和(c)的发酵培养过程中，当ph和溶氧快速上升时，加入发酵补料培养基，并按照如下补料速率进行补料：
9.根据权利要求8所述的方法，所述发酵补料培养基包含：葡萄糖300-500g/kg，优选380-420g/kg；酵母粉25-75g/kg，优选50-60g/kg；大豆蛋白胨25-75g/kg，优选50-60g/kg；和硫酸镁1-3g/kg，优选2-3g/kg。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，进一步包括如下步骤：
